微生物样品采集及快速检测技术

1、微生物样品采集及快速检测技术成都市疾控中心张晓春我们的职责预防、控制和消除疾病的发生与流行防控策略传染源 传播途径 易感人群现场调查的目的 早发现早报告早隔离早治疗确诊 溯源调查 采样 检测一、微生物样品的采集方法（一）样品采集的重要性传染病的监测离不开检测。样品的采集是检测的必要前提。样品的准确采集，是检测结果的有效保证。（二）样品采集遵循的原则生物安全性采样对象合理性、典型性采样适时性采样技术规范性样品保存准确性样品记录完整性样品运送的及时性举例流感病毒分离阳性的45株标本，95.56%为流感样病例发病3日内采样的标本；第4天采样，阳性毒株的分离率为4.44%；超过4天的，流感病毒分离率为

2、0%。采样后7日内送样的标本占95.56%，14日送样的占4.44%，超过14的标本送样率为0%。（三）常见的几种重要传染病的采样及保存运输 流感 不明原因肺炎手足口病其它病毒性腹泻流脑伤寒、副伤寒流感样品：咽拭子、鼻拭子、含漱液采集时间：发病3天内（体温38）短期保存条件：48hr内存于4及一下。超过48hr，存于-70一下环境。样品保存液：Hanks液（23ml/管）及时送检要求：重症或暴发疫情样本24hr以内，监测样本7天内送到流感网络实验室。 不明原因肺炎咽拭子、气管抽吸物、气管分泌物采集时间：发病17天样品保存：3级防护（带生物安全标识可密封塑料袋、密封罐、冷藏运输箱），温度：4送样

3、时间：尽快送至实验室不明原因肺炎血清标本：急性期、恢复期（间隔24周）采样量为5ml静脉血。手足口病（EV71、CoxA16）样品：咽拭子、肛拭子、粪便、疱疹液采集时间：发病7日内粪便（510ml或g，拇指大小，不用加保存液）或肛拭子；发病3日内咽拭子（或深咳痰）；出现神经系统症状3日内脑脊液12ml。疱疹液（75%酒精消毒）短期保存条件：48hr内保存4及一下。超过48hr，存于-70一下环境。 其它病毒性腹泻 样品：肛拭子、粪便（510ml或g，拇指大小）采集时间：症状出现14日，粪便或者肛拭子；短期保存条件：48hr内保存4及一下。超过48hr，存于-70一下环境。样品保存液：Hanks

4、液（或生理盐水）（23ml/管）及时送检要求：重症或暴发疫情样本24hr以内，监测样本7天内送到检测实验室。流脑样品：血液、脑脊液、淤血斑（点）、 咽拭子血液：5ml（3ml注入葡萄糖肉汤血培养基）脑脊液：3ml（2ml常温或温壶注入葡萄糖肉汤血培养基，其余离心涂片或培养）送检时间：尽快送达实验室运送：保温 伤寒、副伤寒样品：肛拭子、粪便、血液采集时间：发病23周粪便（510ml或g，拇指大小，不加保存液）（四）常用必备采样工具15ml螺旋管（血，鼻、咽、肛拭子）60ml螺旋管（粪便、呕吐物、痰）5ml注射器10ml注射器螺旋冷冻管（血清，脑脊液）（四）常用必备采样工具生理盐水塑料封口袋封口膜

5、（样本包装）记号笔（样本标记）样本运输箱培养基与保存液 （五）采样方法咽拭子静脉血水样环境样品粪便组织脑脊液食源性标本咽拭子个人防护主要采样工具：聚丙烯纤维棉拭子采集部位：咽部扁桃体和/或咽喉壁方法：稍用力快速的擦拭主要的采样器材咽拭子含病毒保存液的螺旋管有生物危害标识的可密封塑料袋油性笔、签字笔采样记录单咽拭子采集咽拭子采集咽拭子采集咽拭子采集咽拭子采集咽拭子的采集保存 保存液：hanks液 ， 无菌采样：去掉被手污染的拭子尾部。 温度：4短期保存24hr -70及以下温度保存7天。咽拭子的采集样品记录：采样管上注明编号、姓名、采样日期送检单上注明：项目、编号、姓名、性别、年龄、发病日期、体

6、温、临床症状描述、采样时间、样品种类、采样人或单位。记录填写完整准确，字迹清晰，尽量不要涂改。 一式二份，一份作为送检单，一份送样后留存。疱疹液的采集用皮肤消毒剂消毒挥干后，用针刺破囊疱，用无菌拭子尽量拭抹足够量的疱疹内液体。 将其棉头保存于病毒保存液中折断被手污染的拭子杆尾部肛拭子的采集细菌性肛拭子病毒性肛拭子脑脊液的采集在无菌条件下由腰椎穿刺抽取35ml，放于无菌试管或厌氧瓶内（需厌氧培养时）。 血液标本的采集真空采血管有9种颜色抗凝血：紫色（EDTA）、绿色（肝素）、无抗凝剂的血：红色（无添加剂）、橘红色（含促凝剂）、黄色（含惰性分离胶和促凝剂）血液标本的采集检测抗原抗体：取无抗凝剂的真

7、空采血管，静脉抽血35ml。微量法：去末端静脉血（耳垂、指尖）组织标本主要取病原体侵袭的器官脑组织、心脏、肺、淋巴结、肝、脾等。食源性疾病样品采集可疑食物、水厨房用具（菜板、菜刀）、餐具病人呕吐、排泄物其他环境样品空气：空气采样器、沉降法水：河水等可用滤膜浓缩法。水源水。 环境样品自来水末梢水采集选择采样用500ml磨口无菌瓶先用酒精灯将水龙头烧灼消毒放水510分钟采集水样约300ml。标识样本采样记录：时间、地点、检测项目、采样人环境样品土壤：根据检测目的选择有代表性的土壤，确定采样地点。按对角交叉（五点法）取样，用灭菌工具去除地标枯枝落叶，再铲除1cm左右表层土，以避免地面微生物与土样混杂

8、；用烧灼过的勺或铲取土样月200-300g，状语灭菌器内，并注意保留适当空间，混合后，标明采样地点、深度、日期后送检。 食品其他可能传播途径的物品：病人的呕吐物等尿液标本的采集主要采用中段尿采集法，先用肥皂水清洗外阴部，再以无菌水洗净，一般取首次尿的中段尿1020ml于无菌容器内。 （六）样品交接 样品保存是否正确 字迹能否辨认 样品的合格与否 表格记录与采样管记录的是否吻合 送样人和收样人签字二、微生物检测技术微生物的基本检测技术病原体分离及鉴定抗原抗体检测核酸检测（一）病原体的分离培养及鉴定将微生物接种在人工培养基或者活的的生命体内，称为接种。鉴定可以通过直接镜检、培养特性观察和其他方法。

9、报告结果时间：314天。结果为金标准。（一）病原体的分离培养及鉴定镜检：通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构及染色特性进行观察，直观的了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的 。（一）病原体的分离培养及鉴定生理生化试验；检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定；细菌生化反应快速鉴定系统（API)快速检出细菌毒素抗原检测（一）病原体的分离培养及鉴定使用鉴别培养基：在培养基中加入魔种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现明显差别，因而有助于快速鉴定。1.生化鉴定微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在

10、形态和其他方面不一致的微生物，因此微生物生化反应式微生物分类鉴定中的重要依据之一。细菌微量快速生化检测系统 ，24小时可出结果。1.生化鉴定微量生化系统较传统生化试验方法具有快速性、准确性、微量化和操作简便等优点。在微量生化试验的基础上再配制一套有计算机编码的细菌鉴定手册，就可以对某类细菌进行大量的菌种鉴定工作。 2.检查某些细菌中的专有酶快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定带分离的可以菌株，反应的测定结果有主意细菌的快速诊断。 2.检查某些细菌中的专有酶这种

11、技术将传统的细菌分离与生化反应结合起来，并使得检测结果直观，正成为微生物检测发展的一个主要的发展方向。 2.检查某些细菌中的专有酶已发现某些具有特征性的酶，应用适当的底物可迅速完成细菌鉴定。如，沙门氏菌具有辛酸酯酶，以4MU-辛酸酯为底物，经沙门氏菌酶降解，在uv下观察游离的荧光。用-萘酚辛酯为底物，经沙门氏菌酶降解，释放出-萘酚与固兰作用，出现紫色，反应在纸片上进行，5分钟。2.检查某些细菌中的专有酶Rosa等将样本直接接种于Granda培养基，经18小时培养后，B群链球菌呈红色菌落且可抑制其他细菌的生长。2.检查某些细菌中的专有酶Delise等新和成一种羟基吲哚-D葡萄糖苷酸（IBDG），

12、在-D葡萄糖苷酸酶的作用下，生成不溶性的蓝，将一定量的IBDG加入到麦康凯培养基琼脂中制成MAC-IBDG平板，35培养18小时，出现深蓝色菌落者为大肠埃希氏阳性菌株。其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易于乳糖发酵菌株区别。 3.快速检出细菌毒素检出细菌毒素，常比细菌培养更可靠。肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC)，其血清型多，生化反应不典型，股检查毒素极具诊断意义。4.特异性抗原的检测凝集试验凝集抑制试验沉淀试验其他（二）免疫学检测技术目的是检测抗原或者抗体方法主要有凝集试验、间接凝集试验、沉淀试验、标记免疫技术、免疫层析技术（二）抗原抗体检测技术直接检测抗原检测血清中的IgM双份血清检测IgG标记技

13、术酶标免疫技术（全自动ELISA法）荧光免疫技术放射免疫技术生物素-亲和素免疫技术金标免疫技术金标免疫技术层析免疫与标记免疫技术结合，称为试纸条检测技术，可现场检测（蛋白印迹，western blot)每个检测项目灵敏度特异性不一样流感试纸条现场检测，灵敏度低，但特异性高，一但阳性，则可确诊。HIV、乙肝等则不一样。（三）核酸检测技术PCR技术（PCR,RT-PCR,real-time PCR)转录介导的扩增（transcription mediated amplification, TMA）支链DNA检测(branched DNA signal amplification assay, bD

14、NA)（三）核酸检测技术环介导的等温扩增（loop mediated isothermal amplification, LAMP）Noto-mi 等于2000 年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法( loop-mediated isothermal amplification , LAMP) ,其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物,利用一种链置换DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件(65 左右) 保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP 是一种崭新的DNA 扩增方法

15、,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR 方法的可能性。 （三）核酸检测技术连接酶链反应（ligase chain reaction, LCR）链置换扩增（strand displacement amplification, SDA）（三）核酸检测技术提高了检测的灵敏度；缩短了病原体检出的窗口期；简化了实验操作；提高了检测速度；可对疫情病因做出支撑性判断。（三）核酸检测技术窗口期，是指感染病毒到该病毒能被某种方法检测出来的一段时期。处于窗口期的血液虽然检测不到病毒，但可能具有感染性。（三）核酸检测技术传统的ELISA检测 HBsAg、anti-HCV、HIV的窗口期分别为45d、72d、22d ；用核酸检测（灵敏度