土壤酶活性测定的实验步骤

1、土壤酶的测定三角瓶用稀HNO3 （3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。2.土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次， 14.5x2=29g。一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）试剂配制：（1）0.3%过氧化氢溶液：（1： 100 30%的 H2O2和水）（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水）（1ml30% H2O2+99ml蒸馏水）（2）3N硫酸：（10ml 硫酸+50ml 水）（3）0.1N高锰酸钾溶液：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）操作步骤：2g风干土置100三角烧瓶注入40ml蒸馏水和5ml 0.

2、3%过氧化氢（现配） A在往复式振荡机上振荡20min加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2） A用慢速型滤纸过滤，A吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡 粉红色结果计算过氧化氢酶的活性（M）,以20min后1g 土壤的0.1N KMnO4的毫升数表示：M= （A-B） xT式中：A：空白消耗的0.1N KMnO4毫升数B：滤液消耗的0.1 N KMnO4毫升数T：KMnO4滴定度的校正值备注：以容量法测H2O2的酶活：Kappen(1913 )首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。 此法根据H2O2与土壤相互作用时，未分解的H2O2的数量用容量法(常用高锰酸钾

3、滴定未分解的H2O2)测定H2O2的酶活2 KMnO4 + 5H2O2+3H2SO4辛MnSO4+K2SO4 + 8H2O + 5O2 土壤 H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用二、蔗糖酶（P278）滴定法试剂配制：20%蔗糖：（20g蔗糖+ 80ml水或12.5g蔗糖+ 50ml水）甲苯（分析纯）PH5.5醋酸盐一磷酸盐缓冲液0.5ml磷酸氢二钠12 H2磷酸二氢钾（）磷酸氢二钠12H2： 23.88g Na2HPO4,力口 H2O溶解，定容至100ml。磷酸二氢钾（）：9.072g KH2PO4,加H2O溶解，定容至1000ml。（4）33%KI溶液（4.925g+10

4、ml水）现配，冰箱遮光（5）H2SO4 （1： 3）（体积比）：15ml 98%H2SO4+ 45ml蒸馏水（6）淀粉指示剂取0.5g淀粉溶于少许水中，加10ml煮沸的2.5%NaCl液煮沸1min。（2.5%NaCl： 2.5g NaCl 加 97.5ml 蒸馏水。）（7）0.1NNaS2O3滴定液取25克-溶解于刚煮沸而冷却的蒸馏水中，加入少量的碳酸钠，稀释至1 升。菲林溶液取 3.464 克 CuSO45H2O溶于蒸馏水，并稀释至50ml（a）,取17.3g酒石酸钾钠和5gNaOH溶于 蒸馏水，并稀释至50ml（b），使用前将（a）（b）按1： 1混合。操作步骤取2.5g 土置于100m

5、l三角瓶A用0.375ml甲苯处理15min。加2.5ml20%蔗 糖和2.5mlPH5.5醋酸铅一磷酸盐缓冲液摇匀后放在37度恒温箱中培养24h。培养结束后，加12.5ml蒸馏水。摇荡后过滤，取5ml的滤液移入100ml三角瓶中，加2.5ml的菲林溶液， 在沸水浴上放置10min，冷却至室温后，再加0.75ml 33%KI溶液和1ml H2SO4（1： 3）。加入淀粉指示剂2滴，然后用0.1NNaS2O3滴定。颜色：棕色A棕蓝色A乳白色（滴定结束）注意：减量滴定，一般取5ml即可，滴定需NaS2O3溶液（大量）空白对照：30.15ml（取5ml时）结果计算：蔗糖酶活性（M），用对照与试验的0

6、.1NNaS2O3滴定量毫升数之差表示。试验应设以水20毫升代替基质。M= （A-B） xTx式中：A：对照所消耗的0.1NNaS2O3毫升数B：滤液所消耗的0.1NNaS2O3毫升数T：NaS2O3滴定度的校正值x：换算成1g 土消耗的0.1NNaS2O3量三、脲酶试剂配制PH=6.7柠檬酸盐缓冲液取3.68g柠檬酸溶液于6ml蒸馏水中，另取2.95g氢氧化钾溶于水，再将两 种溶液合并，用1N氢氧化钠将PH调至6.7，并将水稀释至20ml。(2)苯酚钠溶液称62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用乙醇稀 释至100ml(A液)，存于冰箱中。称27gNaOH溶于10

7、0ml水中(B液)，存于冰箱中。使用前，取A,B两液各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。次氯酸钠溶液用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。(17.3mlNaClO 定容至 100ml)。10%尿素液10g尿素+ 90ml水50g尿素+450ml水甲苯氮的标准溶液(不要配)精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的 标准液。绘制氮的标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。操作步骤取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。15min加10ml 10%尿素 液和20mlPH6.7柠檬酸缓冲液。摇匀后在37C恒温箱中培养24h。过滤后

8、取3ml滤液注入50ml锥形瓶中，然后加蒸馏水20ml，再加4ml苯 酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20min后显色，定容50ml： 1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。然 后按绘制标准曲线(显色方法)进行比色测定。结果计算：脲酶活性(M)以24h后1g 土壤中NH3 N的毫克数表示M=xx标准曲线：y=0.0268x+0.001804即：M= (0.001804-y) x式中：x：从标准曲线查得的NH3 N毫克数y： 578nm处吸光度x：换算成1g 土的系数四、磷酸酶1.试剂配制PH=9.8氯化铵一氢氧化钠缓冲液取 20g NaOH 溶于 100mlNH4OH中8%铁氤

9、化钾液称8g铁氤化钾，溶于蒸馏水中稀释至100ml (仅在同一周内存放)2% 4一氨基安替比林液取1g 4一氨基安替比林溶于水中，稀释至50ml (仅在同一周内存放)0.5%磷酸苯二钠溶液取1g溶于200ml水中酚的标准溶液(不要配)酚原溶液的配制及酚工作液的稀释浓度同磷酸苯二钠法酚原液：取1g重蒸酚溶于水中，稀释至1L存于棕色瓶中酚工作液：取10ml酚原液稀释至1L (0.01mg/ml酚)(6)甲苯标准曲线绘制吸取1,3,5,7,9,11,13ml酚工作液，分置50ml的容量瓶中，分别加20ml蒸馏 水，再加0.25ml缓冲液，0.5ml4一氨基安替比林液，0.5ml铁氤化钾液，每次充 分

10、摇动。最后定容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。根 据光密度值于溶液浓度绘制标准曲线。50(20+2 + 0.5 + 0.5 + 0.25)=26.75ml 蒸馏水操作步骤取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加5滴甲苯。20ml0.5%磷酸苯二钠， 充分振荡后在37C恒温箱中培养2h。取培养后滤液5ml，分置50ml的锥形瓶中，加20ml蒸馏水，再加0.25ml 缓冲液，0.5ml4一氨基安替比林液，0.5ml铁氤化钾液，每次充分摇动。最后定 容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。计算磷酸酶的活性(M)，以2h后100g 土壤中P2O5的毫克数表示M =xx80 x0.32x2.