实验二PCR(不跑电泳)

1、PCR的种类和PCR仪普通PCR梯度PCR实时荧光定量PCRLong GeneABIBio-radEppendorf第一页，共三十页。全触摸屏PCR仪（Bio-Rad）第二页，共三十页。什么是聚合酶链式反应（PCR）？ 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。第三页，共三十页。Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，

2、并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片段；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人；1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同

3、作者；1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。第四页，共三十页。第五页，共三十页。20212223N: Molecular numberN0: Original numbern: Cycles E: efficiencyN= N0X2n PCR的指数扩增N= N0X（1+e)n第六页，共三十页。第七页，共三十页。PCR扩增过程DNA模板变性退火: 引物 + 模板新链延伸50607230-40次循环引物耐热的DNA聚合酶退火温度：45-60 延伸时间：1-2kb/min循环数：30-40第八页，共三十页。PCR试剂的作用及使用浓度范围1、DNA模板(

4、template)： 噬菌体的质粒DNA(几纳克几微克)2、dNTP: 4种dNTP混和物。20-200umolL。大于50mmol/L可抑制Taq酶的活性。3、10 PCR缓冲液(buffer): 组分如下: 15mmol/L MgCl2（影响引物退火和解链的温度，影响产物的特异性，影响引物二聚体的形成。浓度范围：。浓度太低无PCR扩增，太高则会出现非特异性扩增） 500mmol/LKCl(有利于引物与模板退火，浓度太高则抑制酶活性)、 100mmol/L Tris.HCl (pH8.3)（缓冲PH） 0.1%明胶（稳定酶的活性）4、引物(primer): 上游引物（M13 F），下游引物（

5、M13 R）（引物终浓度：）6、Taq DNA聚合酶第九页，共三十页。分子克隆3提供的PCR 标准反应条件：模板1pg-1g引物1mol/LDNA 聚合酶15 单位Mg2 1.5mmol/LdNTPs 200mol/LKCl 50 mmol/L第十页，共三十页。影响PCR反应的关键因素1. 引物的质量与特异性；2. PCR循环条件（退火温度）；3. Mg2+浓度；4. 模板DNA的质量；5. 酶的质量。第十一页，共三十页。DNA模板模板浓度：0.01-1 ng （plasmid , phage）； 0.1-1 ug （genomic DNA）；10倍稀释（cDNA）;模板中是否含有蛋白质杂质模

6、板中是否含有Taq酶抑制剂（苯酚）第十二页，共三十页。Enzyme concentration Taq DNA polymerase is between 1 and 2.5 units. 催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少dNTP A working stock containing 1 mM each dNTP is recommended dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，多次冻融会使dNTP降解。第十三页，共三十页。Mg2+浓度： 0.5 - 2.5 mM较合适。Mg2+浓度过高，反应

7、特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。引物浓度： 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。第十四页，共三十页。变性温度和时间 ： 94-95 C for 30 seconds。 变性不完全,往往使PCR 失败 ，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失 。退火温度： 通常PCR的退火温度选择为Tm- 5 oC ; 退火温度越高,所

8、得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。 引物为20mer以下时： Tm=2(A+T)+4(G+C) 引物为20mer以上时： Tm=81.5十0.41(GC)- 600/L 其中L为引物的长度。 第十五页，共三十页。 延伸时间： 1-2kb/min. 延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。 循环数： 35 cycles 循环次数过多，会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。 第十六页，共三十页

9、。退火温度对PCR产物量和特异性的影响第十七页，共三十页。PCR常见问题假阴性： 无扩增条带（漏加模板、引物或酶；酶失效等；引物不合适）假阳性： 非特异性扩增带（退火温度偏低；引物不合适；Mg2+浓度不合适）； 第十八页，共三十页。为什么可以通过PCR扩增得到特异片段模板DNA1st2nd3rd特异性扩展片段%= 0%特异性扩展片段%= 25%特异性扩展片段%= 50%4th特异性扩展片段%= 68.75% .第十九页，共三十页。PCR的特点简便、快速一次性加好反应液，13 小时完成扩增，扩增产物一般用电泳方法即可检测分析对标本的要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等的粗提DNA灵敏

10、度高 理论上13个DNA分子经PCR扩增可获得百万以上个相同的DNA分子特异性强扩增的产物与模板分子特异区域完全相同第二十页，共三十页。PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，肿瘤检测和诊断，转基因产品的检测，动植物检疫法医犯罪现场标本分析其他第二十一页，共三十页。实验材料与试剂1、DNA模板(template)： 噬菌体的质粒DNA2、dNTP: 4种dNTP混和物3、10 PCR缓冲液(buffer): 组分如下: 15mmol/L MgCl2 500mmol/LKCl 100mmol/L Tris.HCl (pH8.3) 0.1%明胶4、引物(prime

11、r): 上游引物（M13 F），下游引物（M13 R）（见“实验指导”）6、Taq DNA聚合酶 (Taq polymerase) 第二十二页，共三十页。PCR的基本步骤1、PCR反应体系的建立取0.2ml的薄壁离心管，按表1顺序加入试剂稍混匀，短暂离心把溶液甩至管底。2、PCR的变温程序（热循环反应）按表2设置PCR反应的变温程序把离心管放进PCR仪进行扩增反应结束后低温保存或检测3、PCR扩增产物的电泳检测 (下次实验)第二十三页，共三十页。PCR的基本步骤1、PCR反应体系的建立（2人一组）取0.2ml的薄壁离心管，按表1顺序加入试剂稍混匀，短暂离心把溶液甩至管底。试剂标记成份1份体积(

12、l)H2OddH2O17.3Buffer10反应缓冲液2.5dNTPdNTPs (2.5mM each)2P1引物1（10uM）1P2引物2（10uM）1DNADNA1rTaqrTaq酶0.2总体积25表1 PCR 反应体系第二十四页，共三十页。2、PCR的变温程序（热循环反应） 按表2设置PCR反应的变温程序把离心管放进PCR仪进行扩增反应结束后低温保存或检测反应阶段循环数 温度持续时间11 94 （预变性） 3min235 94（变性） 30s 52 （退火） 30s 72 （延伸） 30s31 72 （补充延伸）10min 41 12置于12 可短时间保存PCR产物；若需长时间保存取出后置-20 保存表2 PCR反应的变温程序第二十五页，共三十页。引物设计第二十六页，共三十页。PCR引物设计的原则引物长度：16-30nt (202nt)G+C%：40-60%四种碱基应随机分布，在3末端不存在连续3个G或C在引物内，尤其是在3端不应存在二级结构（引物内互补配对）两个引物之间，尤其是3端不能互补。两引物间最好不存