第-08-章-吸光光度法课件

1、*第八章 吸光光度法8.1 吸光光度法基本原理8.2 光度计及其基本部件8.3 显色反应与条件的选择8.4 吸光度测量条件的选择8.5 吸光光度法的应用原子吸收光谱法（或吸光光度法或分光光度法）分子吸收光谱法紫外可见光分光光度法红外分光光度法核磁共振谱法 1、定义：基于物质对光的选择性吸收的分析方法 吸光光度法概述*2、特点：（1）灵敏度高：10-310-6molL-1，适用微量组分的测定。（2）准确度高：比色分析，相对误差510%，分光光度法，25%；（3）应用广泛：可测定几乎所有无机物和许多有机物；生产、科研广泛应用。（4）操作简便、仪器设备易普及。*3、原理：利用物质的颜色深浅与浓度的关

2、系确定其含量 许多物质具有颜色， 例如 MnO4- 粉红Cr2O72-橙黄FeSCN2+血红颜色深浅与浓度有关. 2022/9/17NWNU-Department of Chemistry54、光学光谱区（真空紫外）远红外中红外近红外可见近紫外远紫外10nm200nm中层电子200nm 400nm价电子400nm 800nm价电子800 nm 2.5 m分子振动2.5 m 50 m分子振动50 m 300 m分子转动*6、物质颜色与光互补色光：把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合，成为白光，称为互补色光。无色：对光谱中各种色光透过程度相同。有色：物质的颜色由它透过或反射的光决定。黑色:几乎吸

3、收所有的入射光。白色:几乎全部反射入射光。2022/9/17NWNU-Department of Chemistry8/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490青蓝橙490-500青红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙青蓝650-760红青不同颜色的可见光波长及其互补光*8.1 光的吸收基本定律 朗伯-比尔（Larnbert-Beer）定律一 朗伯-比耳定律(光吸收的基本定律)1. 透光率T和吸光度A 当强度为I0 的一束平行单色光通过任何均匀、非散射性的吸光物质时，一部分被吸收(强度为Ia),一部分被透过(强度为It同时还有部

4、分被折射或反射(强度可略)。则*2. 朗伯-比尔定律A=LcA 吸光度(absorbance)L 介质厚度(length/cm)c 浓度(concentration) 吸光系数(absorptivity)*2）吸光系数(Absorptivity)的单位: Lmol-1cm-1当c的单位用molL-1表示时，用k表示. k摩尔吸光系数(Molar absorptivity) A bc 摩尔吸光系数k的物理意义：它表示物质的浓度为1molL-1、液层的厚度为1cm时，溶液的吸光度。通常配制低浓度的溶液，测得A后，通过计算求得。*（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；（2）不随浓度c和光程

5、长度L的改变而改变。在温度和波长等条件一定时， 仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸收系数max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。 5.摩尔吸收系数的讨论*7.朗伯-比尔定律的分析应用(Analytical applications of Lambert-Beers law) 0 1 2 3 4 mol/LA。 。 。 。*0.80.60.40.20溶液浓度的测定A LcA c工作曲线法(校准曲线)Calibration curve*物理性因素：1、难以获得真正的

6、纯单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯比耳定律的正或负偏离。 非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。 *2、介质不均匀引起的偏离：胶体、乳浊液或悬浮物质溶液吸收、散射。*(2) 化学性因素朗伯比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；仅在稀溶液(c10 -2 mol L-1时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化。 例： CrO42- + 2H+ = Cr2

7、O72- + H2O*3.朗伯-比尔定律的适用条件1) 单色光: 应选用max处测定2) 吸光质点形式不变：离解、络合、缔合会破坏线性关系， 应控制条件(酸度、浓度、介质等)3) 稀溶液： 浓度增大，分子之间作用增强*7、吸收曲线与最大吸收波长 分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同，用不同波长的单色光照射，测吸光度 吸收曲线与最大吸收波长 max；吸收曲线：测量某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，得到的一条吸收光谱曲线。*吸收曲线的讨论：（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max（2）不同浓度的同一种物质，其

8、吸收曲线形状相似max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同，判断干扰。（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。*8.2 目视比色法、分光光度法及光度计一、目视比色法1、定义：用眼睛比较溶液颜色深浅以测定物质含量的方法。2、优点：设备简单，操作方便，不要求严格遵守比尔定律。3、用途: 用在要求不高的常规分析中。4、缺点：准确度不高，标准系列制作麻烦，容易受干扰。*5、测定方法：标准系列法。1）用同质材料的比色管 2）配制不同量的标准溶液 3）同量的显色剂，相同的实验条件，配成一套标准色阶 4）待测物与标准色阶的配制条件相同，置于色阶中比较颜色度 *二

9、. 光电比色法(colorimetry)通过滤光片(filter)得一窄范围的光(几十nm)光电比色计结构示意图灵敏度和准确度较差*三. 吸光光度法(spectrophotometer)光源单色器吸收池检测系统稳压电源通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调, 故选择性好, 准确度高.分光光度法的基本部件* 吸光光度分析法中几种方法对比方法原理入射光单色器检测量常用仪器特点目视比色A=Kbc标准系列复合光透过光强度比色管简便易行 快速、准确度低光电比色A=Kbc标准曲线单色光滤光片吸光度透光率光电比色计准确度较高分光光度A=Kbc标准曲线单色光棱镜或光栅吸光度透光度分光光度计准确度高应用广

10、泛* 光度分析仪器的基本部件无论是光电比色计或分光光度计，都是由以下基本部件组成： 光源 单 色 器 比色皿 光电转换器 检测器作用产生复合光 把复合光变 盛待测液 将透过光转 测量光电流并 成单色光 变为光电流 将其转为A、T 常用 6-12v钨丝灯 滤光片 光学玻璃 光电池、 光电管元件 棱镜 或光栅 石英玻璃、 光电倍增管 光学玻璃*四、光度计及其基本部件 分光光度计*分光光度计* 基本组成光源单色器样品室检测器显示* 主要部件图示：2022/9/17NWNU-Department of Chemistry351. 光源(Light source)：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的

11、光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320 2500 nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180 375 nm)2. 单色器(monochromator)：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜:玻璃350 3200 nm, 石英185 4000 nm光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便2022/9/17NWNU-Department of Chemistry36 单色器入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行 光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或 光栅；聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得 单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝：202

12、2/9/17NWNU-Department of Chemistry37单色器棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同800 600 5004002022/9/17NWNU-Department of Chemistry38光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.2022/9/17NWNU-Department of Chemistry39光栅*光栅*3. 样品室 样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池

13、两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。*4. 检测系统 将光强度转换成电流来进行测量,用光电检测器测量。要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应， 产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。*8.3显色反应及显色条件的选择显色反应：将待测组分转变为有色化合物的反应。显色剂：与待测组分形成有色化合物的试剂。8.3.1 显色反应的选择：1)、显色反应的类型：配位反应和氧化还原反应。*2)、对显色反应的要求：灵敏度足够高:105 超高灵敏，=(610)104 高灵敏,=(26)104中等，2104不灵敏选择性好：显色剂只与一组分（或少数组分）显色显色剂在测定波长处无明显吸收，试剂空

14、白小。对比度：两有色物质最大吸收波长之差=|MAXMR-MAXR|60nm化合物组成及化学性质稳定以及选择性好干扰小。*2. 显色剂无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。有机显色剂：种类繁多偶氮类显色剂：性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大，应用最广泛。双硫腙、偶氮胂III、PAR等。 三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等*3. 显色条件的选择cRcRcR1). 显色剂用量(cM、pH一定)Mo(SCN)32+ 浅红;Mo(SCN)5 橙红;Mo(SCN)6- 浅红Fe(SCN)n3-n用量范围宽用量范围窄严格控制R量*2). 显色反应酸度（cM、 cR一定）pH1pH10 +H2D2 红色

15、518 Pb2+ + pH8-9 +H2D2 粉色 510 Hg2+ + pH6 +H2D2 橙色 485 2.加入掩蔽剂 测Hg2+ +H2D2 + ( EDTA-Bi3+/KSCN-Ag+ ) Sr-mBCZm +硫脲 -Cu/磺基水扬酸Al Fe 2022/9/17523.利用氧化还原反应,改变干扰离子价态 铬天青S+Al3+Vc-Fe3+Fe2+消除Fe3+的干扰 4.利用生成惰性络合物 Ni2+ pH=2 NiR 分解 Ni2+ Fe3+ Zn2+ 5.分离干扰元素 6.利用校正系数 7.利用参比液消除显色剂, 试剂带入的干扰 8.选择适当的测量波长 *化学法 Co2, Fe3+Co

16、2+FeF63-Co(SCN)2 (蓝)NaFSCNCo2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN测Co2(含Fe3+)掩蔽法氧化还原法例:*测Co2 (生成络合物性质不同)Co2+, Zn2+,Ni2+, Fe2+ CoR,ZnR NiR,FeRCoR, Zn2+ ,Ni2+ , Fe2+ 钴试剂RH+如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。测Fe3(控制pH)Fe3+, Cu2+FeSS （紫红）Cu2+pH 2.5SS磺基水杨酸* 8.4 测量条件的选择 8.4.1. 选择适当的测定波长515655钍-偶氮砷III A络合物试剂415500钴-亚硝基红盐

17、A络合物试剂*2）参比溶液(空白溶液)的选择：注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰*8.4.3:吸光度读数范围的选择选A=0.20.8 T 在 20%65% 之间时, 浓度相对误差较小， 最佳读数范围浓度相对误差最小时的透射比Tmin为： Tmin 36.8%, Amin 0.434 通过改变吸收池厚度或待测液浓度，使吸光度读数处在适宜范围。普通分光光度法不适于高含量或极低含量物质的测定。*标准曲线的制作1、制作依据：比尔定律 A =bc吸光度与吸光物质的含量呈正比关系2、制作方法：在选择的实验条件下，从低浓度到高浓度分别测量一系列（不少于5）不同含量

18、的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线（或工作曲线）。此时再测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上就可以查到与之相对应的被测物质的含量。3、标准曲线不通过原点原因：参比选择不当；吸收池厚度不等；吸收池位置不妥；吸收池不清洁等。8.5 吸光光度法的应用*一、天然水中亚铁离子的测定二、饮用水中二氧化氯的测定双硫腙分光光度法测镉在强碱性介质中，镉离子与双硫腙反应，生成红色螯合物，用CHCl3萃取分离后，于518nm处测定其吸光度，标准曲线定量。汞（日本水俣病）（一）双硫腙分光光度法（二）冷原子吸收法 （三）冷原子荧光法采样时，每采

19、集1升水样应立即加入10ml硫酸或7ml硝酸，使水样pH值低于或等于1。若取样后不能立即进行测定，向每升样品中加入5%高锰酸钾溶液4ml，必要时多加一些，使其呈现持久的淡红色。样品贮存于硼硅酸玻璃瓶中，废水样品应加酸至1%。测汞水样的保存与处理 双硫腙分光光度法测汞原理有机汞无机汞H+,氧化剂95测其吸光度标准曲线定量Hg2+双硫腙溶液485nm橙色螯合物CCl4 萃取酸性介质4-氨基安替比林分光光度法测定微量酚测定原理：pH10.00.2的介质中，在铁氰化钾的存在下，酚类化合物与4-氨基安替比林（4-AAP）反应，生成橙红色的吲哚酚安替比林染料，在510nm波长处有最大吸收，用比色法定量。该法所测酚类不是总酚，而只是与4-AAP显色的酚，并以苯酚为标准，结果以苯酚计算含量。 （一）氨氮1、测定意义：有助于评价水体被污染和自净状况2、测定方法 1）水样采集与保存、预处理：絮凝沉淀法、蒸馏法 2）测定光度法离子选择电极法蒸馏及滴定法纳氏试剂光度法水杨酸-次氯酸盐光度法气相分子吸收光谱法