水稻转基因实验方法与步骤

1、水稻转基因实验操作方法步骤一、水稻愈伤组织的诱导（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中（种子数量约占1/3体积），用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿（一般保鲜膜），在暗处适温下（

2、25-28C ）培养5天；3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸 起面向上），暗处适温下（25-28C）培养3天。（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒:1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；3）倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12-14颗；2）操作完毕

3、用封口膜（Micropore TMSurgical Tape）封好培养皿，在28C光照培养箱， 暗培养培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密 呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28 C光照培养箱，继代培养1周（2周愈伤组织更为松散）。（如不马上用，需转移至暗处，于22C继续培养1周）二、农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100W于4ml YEP （含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28C, 250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0 （颜色接 近橙黄色）。三、共培养和抗性愈伤组织

4、的选择感菌与共培养：1）取培养好的菌液500山于1.5ml离心管中，4C, 4000rmp，离心2min,去上清。用 含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01（0.08-0.1 ）；2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟；3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；4）将愈伤组织置于共培养基上。25C暗培养2-3天（表面会长有薄薄的一层农杆菌）。选择：1）将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次（多次洗会更好），其间需不停的振荡。再 用含250mg/l羧苄青霉素钠的无菌水清洗12遍。最后置于无菌滤纸上沥干

5、2小 时；2）将晾干的愈伤转入含250mg/lCarbenicillin （羧苄青霉素钠）和50mg/l潮霉素 的选择培养基上进行第一轮选择，28C，光照培养14天（若农杆菌无法抑制，可加 大抗生素浓度，最大用过500mg/l）；3）将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含250mg/l Carbenicillin和50mg/l潮霉素的培 养基上进行第二轮选择，28C，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。四、抗性愈伤组织的预分化（可选）将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，25C，光照培养7天。五、抗性愈伤组织的诱导分化和生根挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的培养

6、皿或塑料 广口瓶中（每皿或每瓶放置5-7颗），用封口膜封好，放入恒温培养室中，28C，光照培养 （16h光/8h暗），等待分化成苗（15-30天）。待苗长至1cm左右，放入生根培养基中壮苗 注：以上一至五的操作步骤皆在无菌条件下进行。六、转基因苗的锻炼和移栽转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑 出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水（防止培养 基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。附录：各种母液及培养基的配制方法一、溶液配制0.1%升汞：小心称取1克HgCl，用少量蒸馏水溶解后，定容至1

7、000ml。25%次氯酸钠溶液：量取250mlNaClO，用蒸馏水定容至1000ml。激素溶液配制方法：激素溶解方法母液浓度KT加少量稀碱（1M NaOH）溶解，再用蒸馏水定容1 mg/ml6-BA加稀碱（同上）或盐酸溶解，再用蒸馏水定容1 mg/mlNAA加碱溶解（1M NaOH），再用蒸馏水定容1 mg/ml2，4-D加少量稀碱或酒精溶解，再用蒸馏水定容1 mg/mlABA先用乙醇溶解，再用蒸馏水定容1 mg/ml水稻培养液配方（贮备液）：试剂每10升溶液中的克数1. nh4no39142. NaH2PO4-2H2O4033. K2SO47144. CaCl28865. MgSO47H2O

8、32406. MnCl2-4H2O15.0(N%) 6-M7O24-4H2O0.74H3BO39.34分别溶解后加500mlZnSO47H2O0.35浓硫酸，然后再加蒸CuSO45H2O0.31馏水到10L。FeCl36H2O77.0柠檬酸（-水合物）119*使用时，每4L培养液中加1号6号贮备液，各5ml。为使水稻生长健壮，可另加SiO 50ppm100ppm。调节pH值至5.05.1。、培养基的配制:1.培养基母液配方:1) N6培养基母液(20倍)：每升含：KNO356.6gMgSO4-7H2O2.7gKH2PO48g(NHD2SO49.26gCaCl- 2H2O3.32g2) B5微量

9、母液(100倍)：每升含：KI0.0750gH3BO30.30gMnSO4-H2O1.0gZnSO4-7H2O0.2gNa2MoO4-2H2O0.025gCuSO4-5H2O0.0025gCoCl2-6H2O0.0025g3) B5有机母液：烟酸(VB3)1mg/ml盐酸毗哆醇(VB6)1mg/ml盐酸硫胺素(VB1)10 mg/ml肌醇10 mg/ml4) MS培养基大量元素(20倍)：每升含:NH4NO333.0gKNO338.0gCaCl2.2H2O8.8 g(相 当于 CaCl26.644g)MgSO4-7H2O7.4gKH2PO43.4g5）铁盐（100倍）：FeSO4-7H2O2.

10、78gNa2EDTA2H2O3.73 g注：FeSO4-7H2O和Na2EDTA-2H2O分别溶解混合后，需加热煮沸使Fe2借合，最终溶液颜色为深黄色。7） AA大量兀素母液（每升含量）：KCl2.95 gCaCl2-2H2O0.15gMgSO4-7H2O0.25gNaH2PO4-2H2O0.15g2.培养基配方1）粳稻幼胚、成熟胚愈伤组织诱导培养基（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml铁盐：10ml烟酸：1 ml盐酸毗哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 g(2.8g)CH :0.3g2,4-D :2.5ml(2ml)蔗糖：

11、30gAgar8gPH值：5. 8注：括号中为成熟胚愈伤组织诱导培养基成份及用量，其它与幼胚配方相同。以下同2）粳稻幼胚、成熟胚愈伤组织继代培养基（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml铁盐：10ml烟 酸：1 ml盐酸毗哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 g(2.8g)CH :0.3g6-BA (2,4-D)0.5ml(2ml)NAA（不加）0.5ml蔗糖30gAgar8gPH值：5. 83）籼稻幼胚、成熟胚愈伤组织诱导培养基（每升含量）：50mlB5微量：10ml铁盐：10mlMS大量兀素：烟酸：1 ml盐酸毗哆醇：1

12、ml盐酸硫胺素：1 ml肌醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g2,4-D :2.5ml麦芽糖：30gPhytagel:4.0 gPH值：5. 84）粳（籼）稻共培养培养基（每升含量）：N6 （MS）大量兀素：50mlB5微量：10ml铁盐：10ml烟 酸：1 ml盐酸毗哆醇:1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：2 gMES3.9g蔗糖（麦芽糖）： 30gCH :0.5gPhytagel:4.0gPH值：5. 555C时加As至终浓度为200 uM5）选择培养基（MCH/NCH，籼稻/粳稻）每升含量：MS/N6大量兀素：50mlB5微量：10ml铁盐：10ml

13、烟 酸：1 ml盐酸毗哆醇:1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g2,4-D :2ml麦芽糖/蔗糖：30gPhytagel:4.0gPH值：5. 8天菌后再加：Carbenicillin250mg/l第一轮选择：Hyg （潮霉素）50 mg/LCarbenicillin250mg/l第二轮选择：Hyg （潮霉素）50 mg/L6）粳稻预分化培养基配方（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml铁盐：10ml烟 酸：1 ml盐酸毗哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5

14、gCH :0.3g6-BA:2 mlNAA0.1 mlABA5 ml蔗糖：30gPhtagel4.0gPH值5.8天菌后再加Carbenicillin250mg/l7）粳稻分化培养基配方（每升含量）：N6大量兀素：50mlB5微量：10ml铁盐：10ml烟酸：1 ml盐酸毗哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g6-BA:3 mlNAA0.5 ml蔗糖：30gAgar8 gPH值：5. 88）粳稻生根培养基配方（每升含量）：N6大量兀素：25mlB5微量：5ml铁盐：5ml烟 酸：0.5ml盐酸毗哆醇：0.5 ml盐酸硫胺素：

15、0.5 ml肌 醇：5ml蔗 糖：20gagar:7 g9）籼稻分化培养基配方（每升含量）：MS大量兀素：50mlB5微量：10ml铁盐：10ml烟 酸：1 ml盐酸毗哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3gKT:2.5 mlNAA0.5 ml麦芽糖：30gagar:8 gPH值:5. 8Hyg （潮霉素）50 mg/L10）农杆菌生长的YEP液体培养基配方（每升含量）：酵母提取物10g蛋白胨10gNaCl5gpH7.0链霉素（Str）50mg卡那霉素（Kan）或其它抗生素50mg11）农杆菌生长的YM固体培养基配方（每升含量）：KH