两大方法帮你搞定质粒构建

1、两大方法帮你搞定质粒构建质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作 用，分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后， 将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主 细胞内的正确表达。质粒构建方式多样，常规的 T4 连接酶，以及最近更受欢迎 的重组酶方式。下面小编就总结一下 T4 连接酶与重组酶构 建质粒方法，通过比较，其最大的不同点可能在于目的基因 的设计以及连接体系。壹一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶，可以催化粘端或平 端双链 DNA 或 RNA 的 5-P 末端和 3-OH 末端之间以 磷

2、酸二酯键结合，该催化反应需 ATP 作为辅助因子。质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一 般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末 端具有特异性，防止自连。冋选酶切体系VECTOR3 ugCutSmart Buffer5 ul 限制性内切酶 11 ul限制性内切酶21 ul酶切体系一般选择50ul，试剂加好之后37C孵育68小 时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。每隔一段时间振 荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶 回收线性化载体。根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下: (1)前向引物：5 端-保护碱基序列+限制性内切酶 1 酶切 位点序列

3、+基因正向引物序列 -3 端(2)反向引物：5 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切 位点序列+基因反向引物序列 -3 端 如果目的基因片段较长的话，可以选择 PCR 方式扩增目的 基因片段冋选 PCR 扩增体系ddH20 :14ul10 xTaq buffer :2ul10um DNTP : 1ul10um primer F : 0.5ul10um primer R : 0.5ul 模 板 DNA : 1ulTaq 酶：1ul冋选 PCR 扩增条件(1)95C:5min(2) 35cycle95C:30s55C: 30s (退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根 据引物 TM

4、 值降低 5度) 72C: 40s(3)72C:10min(4)16C:hold引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小， 然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基， 回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。载体与目的基因的连接，推荐在1020pl反应体系中进 行接反应。25 ng 25 ng 退火 TOC o 1-5 h z 产物2 ul10 x T4 buffer1 ulT4 DNA ligase1 ulT4 连接酶一般选择 4 度过夜转化 过夜。将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a ）将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a ），涂板，培养挑取单

5、克隆，并鉴定 挑去平板上的单克隆培养，可以通过 PCR 或者酶切初步鉴 定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。下面开始重点介绍重组酶构建质粒，基于同源基因重组原理， 适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆，无需考虑 插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆50 bp10 kb片 段，同时构建时间也大大缩短。载体的制备一般推荐双酶切线性化，线性化完全，假阳性 克隆低。酶切体系同上。对于使用重组方式连接来说， PCR 要设计引物, 设计引 物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列，通过 PCR 扩增方式进行连接， PCR 的产物要纯化。 引物设计原则简单总结一下：（1）前向引物：5

6、端-上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物-3 端 (2)反向引物：3 端-基因反向扩增引物+下游克隆载体末 端同源序列-5 端 如果设计的基因特异插入片段扩增产物长度较长，可以选择PCR 方式进行目的引物的扩增。冋选PCR冋选PCR扩增体系ddH2014ul10 x Taq buffer2 ul10 um DNTPul10 x Taq buffer2 ul10 um DNTP1 ul10 um primer F0.5 ulVector0.5 ul10 um primer R1 ul10 um primer F0.5 ulVector0.5 ul10 um primer R1 ulTaq

7、酶1 ul冋选 PCR 扩增条件(1)95C:5min(2) 35cycle95C:30s55C: 30s (退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根 据引物 TM 值降低5度) 72C: 40s(3)72C:10min(4)16C:holdPCR 扩增后，通过胶回收方式获得纯化的 PCR 产物。纯 化后的 PCR 产物不需要进行酶切，直接用于重组反应。3. 目的引物与线性载体进行重组反应。可选重组体系5 x CE II Buffer4 pl线性化克隆载体50 200 ng插入片段扩增产物20 200 ngExnase? II2 pl在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几

8、次 混匀各组分，置于37 C反应30 min。待反应完成后，立 即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。重组效率在反应30 min 左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆 效率，这样大大减少了连接时间。转化 将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a ),涂板，培养 过夜。挑取单克隆，并鉴定 挑去平板上的单克隆培养，可以通过 PCR 或者酶切初步鉴 定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。 最后，几个主要注意事项：载体克隆位点选择尽量选择无重复序列，且 GC 含量比 较均匀的区域进行克隆。当克隆位点上下游 20 bp 区域内GC含量均在40% - 60%范围之内时，克隆效率将达到 最大.最适克隆载体与插入片段摩尔比为 1:2，即最适插入片段 使用量为0.06 pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以 下公式粗略计算获得：最适克隆载体使用量二0.02 x克隆载体碱基对数ng (0.03 pmol)最适插入片段使用量 = 0.04 x 插入片段碱基对数 ng(0.06 pmol)双酶切 1 和 2，在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及 Activity