流式细胞仪检测凋亡

1、流式细胞仪检测凋亡细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式 细胞仪固有的特点一一可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此，具有其它方法无 可比拟的优越性。本文主要结合我室的一些实际经验，力图简单明了的介绍流式 在检测凋亡方面的应用。下面是一幅凋亡过程图。在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f-1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨 酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后 是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。果用rxil ct/Aainoniycin D时IhLa机袍盈村讳字后、遇击事样发主对时闻*

2、:蠢沽受坯CjncxliniiiL C tiivi IT.筮,台倏斗成姓粒蒂能度俱一 一 埼由船丝览思累将以上晰裂片段出5JC在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经 检测过的方法包括：线粒体功能DNA CycleCaspasesAnnexin V Assay6 DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单 介绍。线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为 BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧 光染料。原理是：正常细胞中，染料可以在线

3、粒体内聚集，发出明亮的红色荧光; 而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中 以单体形式存在，发出绿色的荧光。可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用 488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。整个实验过程操作简单，只 需要30min就可以见到结果。Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。即 使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照 细胞内蛋白检测的步骤。在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征 中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内 侧翻

4、转到细胞膜的外侧。Annexin-V是一种35 36 KD的钙粒子依赖的磷脂结 合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从 而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳 性。因此，常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin-V标记之外，还会加一种DNA 染料，常用的有PI和7-AAD，由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入 细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。下图给出的是在使用FAS单抗诱导前后的检测结果，横坐标是Annexin-V FITC,纵坐标是PI，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细 胞，左下象限是存活

5、的细胞，右下象限是凋亡的细胞。在采用Annixin V方法检测凋亡细胞时，要特别强调一点：该方法适用于悬 浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在胰酶 等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，从而影响检测结 果。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不推 荐用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。Annexih V-Firc3-P4- E Annexih V-Firc3-P4- E 王fiHIMdDNA周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞 内DNA能够和荧光染料，如PI，结合的特性。细胞各个

6、期由于其DNA含量不 同从而结合的荧光染料不同，流式检测的荧光轻度也不一样。G2-M期DNA含 量是G0-G1的两倍，而S期介与两者之间。但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少，因而可以在细胞G0-G1期前面 有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其DNA含 量也是减少的，因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经 风靡一时，现在看来，那时的实验结果需要推敲。尽管，经典的流式检测资料给 出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0-G1期峰的一个峰，死亡的细胞峰离G0 -G1期峰较远，但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法，完全 可以不用这种方法。下图横轴代表

7、PI的荧光强度，纵轴代表细胞数目，各个期根据荧光强度可 以简单的进行区分。晚期凋亡的细胞由于DNA的断裂，因而可以出现DNA ladder，从而也就有 了经典的检测方法TUNEl。流式也能也能进行Tunel检测，其检测原理与经典 Tunel原理基本一致。以BD公司的为例，其利用TdT能将荧光素标记的dUTP 标记到断裂的DNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。但是由于在细胞内标记， 细胞需要进行固定处理，操作类似免疫组织化学法，容易造成假阳性。建议采用 原装大厂的试剂盒，并且严格的设立对照。经过预实验方法稳定后再进行大规模 实验。标本处理后，均可以用荧光纤维镜进行观察，拍照。流式检测后，可以进

8、行精确的计算凋亡百分比。这一点，经典TUNEl是做不到的。dlnYoLMotccl Ffid mi Display 1ONA Af 电dlnYoLMotccl Ffid mi Display 1ONA Af 电380 Volts414 SiltsILgun? I 74 : irlti:!rii-E-r Siftnip fur Mfctcjn L )1 Callis, oil HimlSHrt!1. C.fll日心 Mbcled wiili hotli Pi i PNAj und FTC (ApoptorJc Ccila. 3ihplay 1： Ncm- clum pcl tells arc gateL CJiiIl*点 frcini DLspLay l; A tlrtlc Ls 戒luwn around lEIs iliai Mali11 pcssitix1 with FTC. .n exoeiiipJc1 cl FACZllieii1 m win sjcfting8? is sJKnvji!. Ne