肝癌细胞HepG2与肝癌患者树突状细胞融合瘤苗的体外效应

1、肝癌细胞HepG2与肝癌患者树突状细胞交融瘤苗的体外效应张红梅，张利旺，刘文超，潘伯荣，斯晓明，任军【关键词】细胞交融EffetfavainepreparedbyfusinfHepG2ellsithdendritiellsfrpatientsithhepatellulararinainvitr【Keyrds】dendritiells;ellfusin;arina,hepatellular;iuntherapy【摘要】目的：将肝细胞癌H患者树突状细胞(Ds)与肝癌细胞HepG2交融制备瘤苗，检测其体外诱导同源T细胞产生特异性抗HepG2的免疫效应.要领：以血细胞分散机分散富集H患者外周血单个核细

2、胞PBs，应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGSF)、白细胞介素4(rhlL4)体外诱导造就Ds；聚乙二醇交融Ds与肝癌细胞HepG2,TT法测定交融细胞(Ds/HepG2)刺激同源T淋巴细胞增殖分化本领，细胞毒性实行检测DsHepG2诱导细胞毒性T淋巴细胞(TL)对HepG2的特异性杀伤作用.结果：交融细胞Ds/HepG2高表告竣熟D外貌分子，此中D8390.4%,D8087.7%,D8684.4%,HLADR98.5%；其刺激同源T淋巴细胞增殖的本领明显高于HepG2和Ds；Ds/HepG2活化的TL对HepG2具有明显杀伤作用，其杀伤率为(63.54.6)%效靶比例为201.结

3、论：H患者外周血D交融HepG2细胞可有用诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗H免疫效应，大概成为H免疫治疗的有用途径.【关键词】树突细胞；细胞交融；癌，肝细胞；免疫疗法0弁言肝细胞癌hepatellulararina,H因缺乏特异性肿瘤抗原且抗原性弱，其生物治疗相对困难.树突状细胞(dendritiells,Ds)是体内成效最强的专职抗原提呈细胞，可摄娶加工处置惩罚和提呈抗原，并有用激活T细胞产生抗原特异性免疫应答1.将D与肝癌细胞交融，理论上可实现D对肝癌细胞抗原最充实的提呈，有望得到令人满足的肝癌生物治疗结果.我们使用细胞交融技能将D与肝癌细胞交融，制备交融细胞疫苗，探究其生物学特性及抗肿瘤活

4、性，为肝癌D疫苗临床应用提供实行底子及相干资料.1质料和要领1.1质料RPI1640造就液、T细胞尼龙毛柱购自美国Gib公司；Xviv15无血清造就液购自美国abrexBisiene公司；淋巴细胞分散液、细胞膜荧光染料PKH26，PKH67，500g/L聚乙二醇(plyethyleneglyl，PEG)为美国Siga公司产物；重组人GSF，IL4为美国PeprTeh公司产物；新型重组人肿瘤坏死因子nrhTNF购自第四军医大门生物技能中央；ELISA检测试剂盒购自美国RD公司；抗人FITD80,HLADRAb与抗人PED86,D83Ab均为美国BDPharingen公司产物.1.2要领统计学要领

5、：结果以xs表现，接纳t查验SPSS11.0,P0.05以为有统计学差异.2结果倒置显微镜下，Ds体积较大，可见典范树枝状突起；HepG2细胞略小，贴壁生长；交融后可见典范双核细胞图1.诱导d7,Ds表达D8022.6%,D8613.5%,HLADR32.4%,D83低表达，仅0.34%；与HepG2交融后，上述分子表达显着升高，别离为D8087.7%,D8684.4%,HLADR98.5%,D8390.4%，提示交融细胞具有成熟D特性.荧光显微镜下检测Ds/HepG2细胞交融率约为30%；流式细胞仪检测交融细胞PKH26与PKH67双阳性约占38.2%.2.1IL12排泄交融24h后，Ds/

6、HepG2交融细胞、单纯Ds及单纯HepG2细胞排泄IL12别离为386.231.8,71.138.6,13.25.2ng/L，交融细胞组排泄IL12显着高于单纯Ds及单纯HepG2组n=6,P0.01.2.2T细胞增殖以未加刺激细胞组作为空缺比较，Ds/HepG2交融细胞致敏的T细胞增殖显着，在各浓度的刺激指数SI均明显高于Ds组及HepG2组(n=3,P0.01，图2.2.3TL效应ELISA结果表现Ds/HepG2，单纯Ds及单纯HepG2刺激的T细胞与HepG2共造就24h后，上清中INF含量别离为273.370.7,142.639.2,92.022.2ng/L,Ds/HepG2组显着

7、高于比较组(n=3,P0.01).同时，Ds/HepG2交融瘤苗刺激的T细胞对HepG2细胞杀伤率均显着高于比较组n=3,P0.05;Ds/HepG2,Ds或HepG2刺激的T细胞对非肝癌细胞K562均无显着杀伤活性，提示Ds/HepG2交融瘤苗可有用诱导产生HepG2特异性TL.3讨论原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，此中90%为H，手术切除是如今唯一大概根治的疗法，但术后5a复发率高达40%60%，复发转移已成为H患者恒久保存的重要停滞2.肿瘤疫苗具有激活免疫体系、诱导特异性TL杀伤肿瘤细胞的成效，可用于防范H术后复发转移.作为肿瘤疫苗研究热门之一的D，是如今成效最强的抗原提呈细胞，高程度

8、表达抗原提呈历程必须的H抗原、共刺激分子，可获娶加工肿瘤抗原，将其呈递至T淋巴细胞，诱导产生肿瘤抗原特异性D4+和D8+效应T细胞.如今已报道多种D疫苗制备计谋，重要包罗将肿瘤相干抗原基因导入D3-4，应用合成抗原肽、肿瘤抗原提取物、抗奇特型抗体或细胞性肿瘤抗原致敏D5-6等.但多数肿瘤的相干抗原并不明白，且有用的T细胞免疫应答需针对差异肿瘤抗原的多个T细胞克隆协同作用.因此，以单一肿瘤抗原刺激D举行免疫治疗，一方面特异性肿瘤抗原难以猎取，另一方面未必激活有用的TL，且技能条件要求较高，不宜临床推广.而D与肿瘤细胞交融计谋7，理论上可将全部肿瘤抗原结合于D，使其既具有肿瘤细胞的全部抗原性，通过

9、D抗原提呈成效为HI类分子复合体提供一连的内源性肿瘤抗原8，又具有激活T细胞的成效.我们以H患者外周血PB为泉源诱导D，经rhGSF,rhIL4体外造就1k后，与肝癌细胞HepG2交融.流式细胞仪检测表现D/HepG2交融细胞表达高程度HLADR,D83,D80,D86等成熟D成效分子，显着高于交融前D表达上述分子的程度；同时，交融细胞IL12排泄量显着增长，提示细胞交融计谋可促进D成熟，使其得到强盛的抗原提呈成效和激活T细胞的本领.混淆淋巴细胞反响证明交融细胞可有用刺激同源T淋巴细胞增殖，明显高于单纯D和HepG2的刺激本领.活化T细胞排泄IFN的程度可作为细胞毒性效应的检测指标之一，我们接

10、纳ELISA法测定D/HepG2交融细胞致敏T细胞排泄的IFN，创造其排泄量明显高于比较组；体外杀伤试验表现交融细胞诱导产生的TL对HepG2具有明显的特异杀伤作用.我们的结果表白，H患者D与H细胞交融，可有用诱导特异性抗H免疫应答，有望成为治疗和防范H转移复发的新途径，该要领对未明白特异抗原的肿瘤举行D自动性免疫治疗也具有很强的有用代价.【参考文献】1YaV,Platell,HallJ.DendritiellsJ.ANZJSurg,2002,72(7):501-506.2aiRL,eng,LuHY,etal.Segregatinanalysisfhepatellulararinainader

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