原核生物的基因表达与操作课件

1、重组基因的原核生物表达体系与产物的分离纯化目的基因 载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA基因克隆的技术路线重组基因表达的目的 1. 蛋白质功能研究 2. 生物制药和疫苗生产 3. 疾病的基因治疗 4. 食品、化工用酶制剂 5. 抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集重组基因表达体系1. 原核体系2. 真核体系 大肠杆菌枯草杆菌乳酸菌沙门氏杆菌苏云金杆菌酵母细胞昆虫细胞植物细胞、组织动物细胞、组织大肠杆菌中表达体系的不足：1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNA聚合酶不能识别真

2、核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异， 影响真核基因mRNA稳定性。4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。 启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子 原核生物基因表达载体的组成特征 启动子核糖体结合位点转录终止子大肠杆菌表达载体报告基因（reporter gene）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳

3、糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。大肠杆菌的Lac启动子 来自大肠杆菌的乳糖操纵子 由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组成 受活化蛋白和cAMP 的正调控，阻遏蛋白的负调控受IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳糖苷）、ONPG（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导LacUV5启动子：Lac启动子的衍生物大肠杆菌的trp启动子

4、来自大肠杆菌的色氨酸操纵子由启动子、衰减子、操纵基因及trpE的部分结构基因组成受阻遏蛋白和衰减子的调控，阻遏蛋白前体必须与色氨酸结合才有活性 3-吲哚丙烯酸（IAA）可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，提高转录活性。 噬菌体的左向启动子PL来自噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启动子高约11倍；受控于温度敏感的阻遏蛋白cI 。在低温(28-30)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(42)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体1）强启动子: tac（trp-lac） 2）操纵基因：乳糖操纵子系统 trp

5、的-35区 lacUV5的-10区 lac操纵基因 常用大肠杆菌表达载体 3）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解） 条件： 必须选择一个有lacI的宿主菌。非融合蛋白：指所表达的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸。 所表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 非融合蛋白特点： 表达时要求高：SD序列与ATG的距离要 合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也 会大受影响。 优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。 缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降 解，蛋白产量低；分离纯化费时费力， 成本较高。2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信

6、号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, 1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。 2）调节基因：lac I 。3）S-D序列和起始密码ATG。 4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位点区（多克隆位点）。 融合蛋白表达系统的构建的三个原则： 首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。 其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定了融合

7、蛋白的裂解方法。 最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外生命科学学院第二节 外源基因在原核细胞中的表达用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来pGEX-2X的插入区pGEX-1X的插入区pGEX-3X的插入区4.其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签） 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。这样的蛋白质有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。

8、 外源基因在原核细胞中的表达位于细胞质细胞周质细胞外表达产物形式包涵体蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白 目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细 胞总蛋白的20%40%。 目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借 助于身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最 终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。包涵体蛋白 本质：细胞内蛋白质的不断聚集 包括：1.折叠状态的蛋白质的聚集作用

9、； 2.非折叠状态的蛋白质的聚集作用； 3.蛋白质的中间体结构。 优点：易于分离纯化 在一定程度上保持表达产物的结构稳定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分， 菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白包涵体表达形式的优点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生 物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收 率至关

10、重要。 经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性， 有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。包涵体表达形式的缺点 分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤： 破碎细胞 (Disruption of cell) 分离包涵体 (Seperation of inclusion body) 溶解包涵体 (Dissolve inclusion body) 蛋白质产物的构象复原等。 (Recovery of target protein conformation)包涵体

11、的复性前准备洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。包涵体的溶解 1.采用高浓度的变性剂，使其形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GuaHCl 6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GuaSCN）最强。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋白

12、只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。2.去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用（研究）。 3.极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如在pH9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 4.还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM DTT，也有使用5mM浓度。实际，还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，

13、而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。(伸展态)U(中间态)I(自然态)N A（包涵体） 从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。 蛋白质折叠的三态模型复性目的 复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂

14、使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。 蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。 包含体蛋白复性方法几个要求：活性蛋白的回收率高正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品复性过程耗时少复性常用方法 1.稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺点是体积增加较大，后续处理困难。

15、稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体（较低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL。 脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中，使折叠中间体保持在较低的水平。例：在5-10mg/mL终浓度下，溶菌酶复性收率可达80%以上。 2.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作，无法应用到生产规模。 3. 超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集于膜上）。4.色谱复性：辅助手段，兼具分离。 4.1 凝胶过滤复性：除了蛋白

16、质在胶粒中传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白质的复性有利。 4.2 吸附型层析复性：离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。Solid-Phase (or Matrix-assisted) Refolding IB inE. coliIB(solid)Solubilized IB(unfolded)Aggregat

17、eRefolded Bioactive monomerRefoldingSolution-stateFSolid SupportFunctional GroupSolid-state refoldingRemove DenaturantF 5.分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。 体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行共表达；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。复性过程中的添加剂 低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折

18、叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。 盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是有效的促进剂。 In-Vitro Refolding PathwaySSSSUnfoldedAggregateIntermediate(molten globular)3D Structure(Bioactive)SSSSCorrectly FoldedIntramolecularMisfoldingSSSSSSSSSSSSIntermolecularMisfoldingStandard IB Renaturation Pr

19、ocess Cell DisruptionRefoldingPost-refolding purification stepIB IsolationIB WashingSolubilizationCentrifugation Remove Cell DebrisDenaturantPartial Removal of DenaturantComplete Removal of DenaturantIBDissolved Refolding包涵体分离纯化过程61细胞培养收获细胞细胞破碎离心5 - 10 000g沉淀物冲洗和离心分离包涵体亲和纯化和复性溶解包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离每 10

20、0 ml 培养液重新悬浮细胞沉淀物於 4 ml 20 mM Tris -HCl pH 8.0 在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在+4C下高速离心 10 分钟重新悬浮细胞沉淀物於 2 ml 含 e.g. urea 的冲洗缓冲液和再度超声震荡并在+4C下高速离心 10 分钟用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物622 M UREA20 mM Tris HCl2% Triton X1000.5 M NaCl溶解和准备样品重新悬浮细胞沉淀物於 5 ml 溶解缓冲液 (e.g.):20 mM Tris -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 863在室温等

21、 30-60 分钟在+4C 离心 15 分钟用 0.22 m 或 0.45 m 濾膜过滤载体和标记纯化pGEX谷胱甘肽 S-转移酶 GST MicroSpin Purification Module,GSTrap, Glutathione Sepharose Fast FlowPQE6 x 组氨酸His MicroSpin Purification ModulepETHisTrap, HiTrap Chelating, 6 x组氨酸Chelating Sepharose Fast FlowpEZZ 18 (非诱导性表达) 蛋白 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast

22、FlowpRIT2T (利用温度改变诱导)蛋白 A 的 IgG 结合区 IgG Sepharose 6 Fast Flow亲和层析纯化65GST 融合蛋白的纯化GST重组蛋白 酶切位点Factor Xa:Mr 17-20 000 / 28-30 000Thrombin: Mr 37 000PreScission Protease:Mr 46 000Glutathione Sepharose Mr 26 00010C66SDS PAGE analysis020406080100% Elution buffer00.51.01.52.02.53.03.55.010.015.020.0ml minW

23、ashElutionbuffer2.7 mg pure GST fusion protein5.010.015.020.0A280kD9414.420.13043671 2 3柱:GSTrap 1 ml样品:8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液结合缓冲液:PBS, pH 7.3洗脱缓冲液50 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM 还原谷胱甘肽流速:1 ml/min层析 步骤:4 CV结合缓冲液, 8 ml 样品, 10 CV结合缓冲液, 5 CV洗脱缓冲液, 5 CV结合缓冲液(CV = 柱体积) 系统:KTAexplorer 101:低分子量标记 (LMW) C

24、alibration kit, 还原, Amersham Pharmacia Biotech2:胞浆萃取液, 1 g /10 ml3:洗脱GST 融合蛋白67(His)6 融合蛋白的纯化和检测重组蛋白HisHisHisNi2+HisHisHisHisNi2+Ni2+Ni2+69SDS PAGEFlow through加样结合液洗脱液结合液AA280280AA4054051.00.50.00.700.600.500.400.300.200.100.05.010.015.020.0Volume (ml)ElutedpoolWashkDa94.067.043.020.114,41 2 3 4 5 6 7 8样品:5 ml大肠杆菌表达含(His)-标记谷胱甘肽转移酶，GST-(His)6柱:HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+结合缓冲液:1X 磷酸缓冲液, 20 mM 咪唑 pH 7.4洗脱缓冲液:1X 磷酸缓冲液, 500 mM咪唑 pH 7.4流速: 2 ml/min, 312 cm/h结果:洗脱 GST-(His)6, 4 ml, A280: 1.65 总量: 4.46 mg1:低分子量标记 (LMW) 2:样品稀释 1:203:穿透稀释 1:104:冲洗液5:洗脱 GST-(H