血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定-10-10课件

1、 血清白蛋白、-球蛋白的分离、纯化及鉴定目的要求(一)掌握分离纯化蛋白质的基本原理。(二)了解柱层析技术。分工合作盐析混匀时需要两个人合作。色谱柱专人收集洗脱液，专人检测样品是否流出。脱盐、纯化两次操作类似，都有动手的机会。操 作一、盐析 白蛋白、球蛋白的粗分离 取0.5ml血清 取0.5ml饱和(NH)SO溶液， 缓慢滴入，边加边摇（？）。 混匀后于室温中放置10min。（一）分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽

2、糖、糊精以及糖浆等。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程的需要（三）分离纯化的一般程序生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段： 材料的选择和预处理 破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离） 分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。选择材料破碎细胞提取分离纯化分析及鉴定常用的蛋白质分离纯化技术溶解度盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀分子大小透析、超过滤密度梯度离心、凝胶过滤带电特性电泳、离子交换层析吸附特性吸附层析对配体分子的亲和性依据性质方 法用于粗分用于细分亲和层析、金属螯合层析盐析的基本原理蛋白质水溶胶的稳定因素：水化膜和电荷。中性盐的亲

3、水性大于蛋白质分子的亲水性。 破坏水化膜，暴露出疏水区域， 中和电荷，破坏亲水溶胶溶解度盐浓度Salting-outSalting-in+等点电时的蛋白质（亲水胶体）带负电荷蛋白质（亲水胶体）脱水脱水脱水带负电荷蛋白质（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒阴离子阳离子碱酸酸蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质（亲水胶体）碱+水化膜带正电荷蛋白质（疏水胶体）2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75的杂蛋白，纯度提高了四倍。3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有 的酶或蛋白质用23mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。4) 价格便宜，废液不污染环境。分段盐析不同的

4、蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%饱和度饱和析出析出1) 清蛋白等电点是4.0，2球蛋白等电点是5.06，球蛋白等电点是5.1，球蛋白等电点是7.1。 2) 清蛋白的分子量远小于球蛋白石油醚（流动相M）植物叶子的石油醚萃取液(样本)碳酸钙（固定相S）玻璃管（色谱柱）胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A、B连续色带（色谱）1906年俄国植物学家米哈伊尔.茨维特一基本概念色谱法：利用混合物中各组分的理化性质的差异（吸附力、溶解度、分子形状

5、和大小、分子极性、分子亲和力、电荷等），使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相叫固定相，另一个相流过此固定相叫流动相。由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力不同，使各组分产生不同的移动速度，从而使结构上具有微小差异的各组分得到分离的过程，称之为色谱法。二特点1、高效能2、高度选择性3、高灵敏度4、操作简单不足之处：定量精确，但定性较差 色谱三、色谱的种类气相色谱液相色谱气液色谱气固色谱液液色谱液固色谱1、吸附色谱法2、分配色谱法3、离子交换色谱法4、凝胶色谱法5、亲和色谱法按原理分类二、脱盐（凝胶层析法）透析只用于除盐类和小分子杂质凝胶层析又叫分子筛层析。 具备条件：1

6、惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子筛： 葡聚糖凝胶（Sephadex） 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA） 孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。 离子交换色谱（ion exchange chromatography） 以离子交换剂为固定相，利用样

7、品中不同的生物大分子的带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱不同，而将混合物中的不同离子进行分离的色谱技术。 三、纯化（离子交换色谱法）阳离子交换剂（cation exchanger）两种离子交换剂阴离子交换剂（anion exchanger）RSO3H+ + Na+RS O3 Na+ + H+RNH4 OH+ClRNH4+ Cl+OH离子交换剂的化学成分 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小； 2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱。阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二

8、乙氨乙基纤维素阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集球蛋白中： 及球蛋白的pI6.5，带负电 而球蛋白的pI6.5(pI7.3) ，带正电 球蛋白先洗脱出来。白蛋白中： 、及白蛋白均带负电，挂于柱上 先用低盐洗去、球蛋白 再用高盐竞争洗下白蛋白DEAE纤维素阴离子交换层析:本次实验纯化采用操 作一、盐析 白蛋白、球蛋白的粗分离 取0.5ml血清 取0.5ml饱和(NH)SO溶液， 缓慢滴入，边加边摇（？）。 混匀后于室温中放置10分钟。 8000r/min10min 小心吸取上清液，作为纯化白蛋白用。 沉淀加0.5ml蒸馏水，使之溶解，作为纯化

9、 球蛋白用。洗脱液中蛋白质及盐分的检查取96孔板一块，上四排加20磺基水杨酸，下三排加BaCl2液。从下端管口取1滴洗脱液，滴于20磺基水杨酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出。从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl2中，出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。二、G-25凝胶层析脱盐（一）葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备（二）上样与洗脱：1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床)。2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整)。3、开下端出口，使样品进入

10、凝胶床（刚好下降到凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量pH6.5的0.02mol/L NH4Ac缓冲液。4、放开，流速约20滴/分钟，立即收集并检测， 20磺基水杨酸检测到蛋白后收集三管，10滴/管。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。5、 BaCl2检测出现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。6、平衡再生：继续洗脱30ml。7、白蛋白样品脱盐。 15滴/管收集三、纯化（阴离子交换层析）将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上，用0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗脱，分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，10滴/管，编号。（纯化的-球蛋白）继续洗脱30ml将脱盐后含白

11、蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/L NH4Ac洗脱30ml。（午餐休息1小时）改用0.3mol/L NH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/管，编号。（纯化的白蛋白）再生： 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4Ac 20ml， 0.02mol/L NH4Ac 40ml。四、醋酸纤维素薄膜电泳检查（1）血清（2）粗分的-球蛋白液（3）粗分的白蛋白液（4）纯化的-球蛋白液（5）纯化的白蛋白液样品： 以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动，由于迁移率不同而被分离。实验原理 1准备与点样2. 电泳（点样面朝下，110V 1h）3氨基黑10B染色5分钟4. 漂洗2cm粗糙面操作步骤学号（1）血清（2）粗分的-球蛋白液（3）粗分的白蛋白液（4）纯化的-球蛋白液：由于此