2023-3-25新苗杯申报书修3333

1、浙江省大学生科技创新活动方案新苗人才方案工程申报书创新工程名称： WHBE兔红细胞免疫功能与CR1 基因表达的相关性研究 创新工程负责人：孙朗朗工程负责人专业：生物工程学校名称：浙江中医药大学申报日期：2023 年 3 月25 日工程类别：大学生科技创新工程大学生创新创业孵化工程大学生科技成果推广工程浙江省大学生科技创新活动方案新苗人才方案实施办公室 制填写说明一、申报书要按照要求，逐项认真填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨。二、格式要求：申报书中各项内容以Word文档格式填写，表格中的字体为小四号仿宋体，1.5倍行距；表格空间缺乏的，可以扩展或另附纸张；均用A4纸双面打印，于左侧装订成

2、册。三、申报书由所在学校领导审查、签署意见并加盖公章后，一式2份均为原件，报送至团省委学校部。一、工程简介项目概况工程名称 WHEB兔红细胞免疫功能与CR1基因表达的相关性研究工程性质根底研究 应用根底研究工程来源自主立题 教师指导选题起止时间自 2023年 01月 至 2023 年12月工程状况1、研发阶段 2、中试阶段 3、批量规模生产选项打申请人姓名孙朗朗性别男出生年月1990.09学历本科生所在院系生物工程联系 电子信箱987215051qq 项 目 组主要成员姓名性别学历专业具体分工杜勇男研究生生物化工荧光定量PCR检测mRNA表达量燕架军男本科制药工程RNA提取和血样采集叶洪琳女本

3、科生物工程C3b受体花环率测定刘维琪女本科生物工程免疫复合物花环率测定项目指导教师姓名赵伟春性 别女 出生年月1973.10职称副教授主要研究方向中药活性成分别离提取及作用机理研究近三年获奖成果：国家级_等奖 0 项，省部级_等奖 0 项近三年科研经费 6 万元，年均 2 万元项目主要内容简介 1采集兔血样，制备红细胞悬浮液，测定红细胞C3b受体花环率E-C3bRR和红细胞循环免疫复合物花环率E-ICRR，比较不同发育期WHBE兔和JW兔红细胞免疫功能差异；2采集兔骨髓，提取总RNA，通过荧光定量RT-PCR技术检测各实验兔CR1基因 mRNA的表达量，比较不同发育期实验兔CR1基因mRNA表

4、达量；3分析WHEB兔红细胞免疫功能与CR1基因表达的相关性。二、工程研究目的、意义及创新性1、申请工程的必要性、目的及意义1申请工程的必要性红细胞免疫功能的研究在医学领域中具有重要的意义，各种疾病状态下人类红细胞免疫功能及CR1表达的变化已经通过直接检测人体血液的相关指标得以研究。但是，增强或调控红细胞免疫功能的药物筛选及药效研究必须借助于符合临床疾病发生开展规律的动物模型。但目前还缺乏相关的动物模型。实验兔是教学科研中重要实验动物，开展实验兔红细胞免疫低下或缺陷模型研究，不仅为动物医学和中医药的研究开发提供理想的动物模型，而且可为实验兔在生产繁殖及疾病的防治、保持实验兔的优良品质等方面提供

5、可靠的监测指标。CR1作为红细胞免疫功能的重要物质根底之一，测定其水平、研究其变化规律及其分子机理对了解某些疾病的病情和判定治疗反响具有重要的意义。WHBE兔是白毛黑眼兔White Hair Black Eyes Rabbit的简称，是在日本大耳白兔JW兔生产群中发现一只雄性白毛黑眼兔，通过与雌性JW兔交配的后代回交后出现的白毛黑眼兔，再用同胞和半同胞交配的方式，将白毛黑眼的性状固定后，连续封闭扩群繁殖而来的实验兔封闭群。它与目前常用的JW兔相比，具有心功能强、免疫反响敏感、产生抗体效价高、红细胞与网织红细胞低、淋巴细胞高、血液学参数指标与人类较为接近，尤其是网织红细胞生成指数与人相近等特点。

6、提示WHBE兔的红细胞免疫功能可能更接近于人类，因此，WHBE兔可能是人类红细胞免疫功能和红细胞老化研究较好的模型动物，开展WHBE兔红细胞免疫功能研究对于更好的开发和利用WHBE兔具有重要的科学意义。2申请工程的目的及意义本工程在研究WHBE兔和JW兔红细胞免疫功能与CR1基因表达的相关性的根底上，获得WHBE兔和JW兔CR1基因cDNA全序列并比较了二者的差异。通过本工程的研究，为明确WHBE兔红细胞免疫功能的特性提供实验依据，为WHBE兔的培育、遗传检测和分子生物学特点的进一步研究奠定根底。有助于说明WHBE兔红细胞免疫功能特性的分子机制，为明确WHBE兔是否比JW兔、NZW兔更适于红细

7、胞免疫相关疾病、机体衰老等的研究奠定根底，借以扩展在生物市场上的应用价值。2、工程的背景、主要内容、技术水平及应用范围1工程的背景红细胞免疫功能的研究是当前的一个热点。红细胞是血液中含量最多的一种有形成分，具有识别、粘附、杀伤抗原、去除循环免疫复合物IC、参与机体免疫调控等多种功能1。红细胞免疫功能缺陷与自身免疫性贫血、慢性肝病、系统性红斑狼疮、肾病、冠心病、恶性肿瘤以及中医血瘀证等疾病密切相关5。机体衰老和老年性疾病的发生也与红细胞免疫系统异常息息相关1。红细胞免疫功能测定的方法主要为补体致敏的酵母菌花环试验。红细胞拥有如型补体受体CR1，C3b/C4b受体又称CD35、补体受体、降解加速因

8、子、超氧化物歧化酶、NK细胞增强因子、-内啡肽受体和肾上腺素受体等许多与免疫相关的物质。红细胞的调理促吞噬作用、免疫调控作用、粘附作用、去除IC及炎症作用等均通过补体受体介导，其中CR1是红细胞免疫功能最重要的物质根底之一2。人的CR1基因位于第1号染色体长臂32区的补体激活调节子区，由145638个核苷酸组成。其内含子7.4kb和6.9kb Hind 酶切片段可区分红细胞CR1密度相关三种基因型。但是B淋巴细胞、T淋巴细胞和粒细胞等的CRl表达与上述酶切位点无关8。肝癌、2型糖尿病、急性白血病等疾病患者的红细胞免疫功能低下与CR1密度基因突变型L的缺陷表达有关6。兔CR1基因的研究较少，从G

9、enbank中仅检索到家兔Oryctolagus cuniculus 新西兰品系NZW兔CR1基因共673个核苷酸的局部cDNA序列，该序列编码224个氨基酸残基，其CR1基因和cDNA全序列未见有研究报道4。国内外对兔红细胞免疫功能的研究主要集中在三个方面。利用补体致敏的酵母菌花环试验证明实验兔红细胞免疫功能随年龄递增逐渐衰退，同种实验兔不同品种间其红细胞免疫粘附活性也不同9。研究实验兔疾病或疾病动物模型中红细胞免疫功能的变化。已经证实，在免疫性疾病、动脉粥样硬化、中医证候等实验兔模型以及实验兔创伤性疾病、寄生虫病等疾病中其红细胞的免疫功能均有显著下降3。增强实验兔红细胞免疫功能的药效实验。

10、比方通过灌服免疫增强剂、中药添加剂及中药复方或是利用针灸疗法等处理来提高实验兔的免疫功能7。但是，所有研究均未涉及实验兔CR1基因结构及其表达产物含量的变化。已有的研究中，在基因水平上，只有家兔CR1局部cDNA序列的研究，未见有实验兔CR1基因全序列及其基因多态性和cDNA全序列的报道。在蛋白水平上，只有CR1蛋白局部片段的氨基酸残基排列顺序，未见有CR1蛋白全分子组成及其多态性的研究，这严重影响有关实验兔免疫功能在不同发育期、不同品种间、疾病状态或药物作用下存在差异的分子机理的研究，进而影响实验兔作为动物模型用于人类相关疾病及衰老的研究。而近期所做的预实验的结果，显示了不同发育期不同实验兔

11、的红细胞免疫功能与CR1基因的表达差异存在着必然关系。2工程的主要内容1通过测定红细胞C3b受体花环率E-C3bRR、红细胞循环免疫复合物花环率E-ICRR和红细胞免疫粘附肿瘤细胞能力，明确不同发育期WHBE兔和JW兔红细胞免疫功能的变化规律；2采用荧光定量RT-PCR技术检测各实验兔CR1基因 mRNA的表达量，探讨不同实验兔mRNA转录水平与红细胞免疫水平间的相关性。3实验方法及技术1) 红细胞C3b受体花环率和红细胞循环免疫复合物花环率的测定血样的采集WHBE兔和JW兔按月龄分为幼年兔0-3月龄、青年兔318月龄、壮年兔1830月龄和老年兔30月龄以上四组，各组均雌雄各6只。实验前将所有

12、实验兔禁食8h后，从耳中央动脉采血1.5 mL，置于枸橼酸钠抗凝管中，混匀。红细胞悬液制备将实验兔抗凝血1.5 mL，加PBS液15 mL及适量淋巴别离液，2000r/min离心5 min，弃白细胞、血浆层及淋巴别离层，再用PBS洗涤34次，用HankS液配制成1.25107个/mL红细胞悬液。致敏酵母菌悬液制备 取未致敏酵母多糖冻干试剂1支，参加2mL PBS液，37水浴融化并混匀，2000r/min离心5min，弃上清，加PBS1mL和等量的豚鼠血清，混匀，37水浴30min，然后再以PBS液洗涤2次，调整酵母菌浓度为1108个/m1即为致敏酵母菌悬液。未致敏酵母菌悬液制备 取未致敏酵母多

13、糖冻干试剂1支，参加2mL PBS液，37水浴融化混匀，2000r/min离心5min，然后再以PBS 液洗涤2次，调整酵母菌浓度为1108个/m1备用。红细胞C3b受体花环率及红细胞免疫复合物花环率测定取2支试管，每管加待测红细胞悬液50L，第一管加补体致敏酵母多糖悬液50L，第二管加酵母多糖悬液50L，混匀，置于37水浴30min，取出轻轻摇匀，加生理盐水100L2) 实时荧光定量PCR检测CR1基因的mRNA表达量骨髓的采集成熟红细胞无细胞核，其细胞膜上的CR1蛋白由骨髓幼稚红细胞的CR1基因表达而来。因此，采集骨髓检测CR1基因的表达量。将实验兔禁食12h，从耳静脉缓慢注射3%戊巴比妥

14、钠1mL/kg溶液麻醉，剪去股骨大转子外侧的毛，用8%硫化钠处理3min脱去细毛，再用清水洗涤3次，用碘伏擦拭皮肤，再用75%酒精擦拭两遍。将兔自然仰卧位，双后肢自然伸直。以股骨第三转子下0.3-0.5cm处穿刺点，在股骨外侧嵴偏前，于胫骨前偏外1/3处，向后30-40，向上40-60方向，骨髓穿刺针透过皮质骨进入髓腔0.8-1.2cm后，用带有1.5mL2000U肝素钠的无菌注射器吸取骨髓3mL，立即混匀防止凝血。RNA的提取采用Trizol RNA提取试剂盒提取RNA，将提取的RNA取1L测定A260/A280，并计算其浓度，然后用常规1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，-80实时荧光定量

15、RT-PCR根据兔CR1基因的mRNA局部序列ACCESSION：EU407475设计引物。采用SYBR PrimeScipt TM RT-PCR Kit进行实时荧光定量RT-PCR。.反转录：10L 反响体系中含5 PrimeScript TM Buffer 2L，PrimeScript TM RT Enzyme Mix 015 L，Oligo dT Primer 25 pmol，随机引物50 pmol，Total RNA 1L，DEPC水加至10L。上述成分混匀后置于PCR仪器中，反响条件：37 15 min，85 5s，.标准曲线的建立和目的基因的定量：取4.5L cDNA模板按2倍浓度

16、梯度做标准曲线。取2L分别对CR1基因和-actin基因进行QRT-PCR扩增，每样本重复3次，另加3个无模板的阴性对照，依次在冰上加样：1 SYBR Premix Ex TaqTM，上、下游引物各0.2mol/L，1 ROX Reference Dye (50 )，cDNA 模板2 L，灭菌蒸馏水加至20 L。PCR扩增程序：95 预变性10 s；95 5 s，55 20 s，72 10 s，404技术水平及应用范围本工程在红细胞具有免疫功能的根底上，深入研究CR1基因mRNA的表达量与红细胞功能的相关性，利用红细胞免疫能力测定和荧光RT-PCR技术从蛋白和基因水平研究，探讨不同发育期不同实

17、验兔的CR1基因表达量差异对红细胞免疫功能的影响这不仅为动物医学和中医药的研究开发提供理想的动物模型，而且可为实验兔在生产繁殖及疾病的防治、保持实验兔的优良品质等方面提供可靠的监测指标。更重要的是，对于国内生物药物快速开展提供了技术支持，今后开发新药假设能应用于临床，将具有良好的开发前景及应用价值9。3、实施该工程所具备的根底、优势和风险本实验室配有定性PCR仪、荧光定量PCR仪、Bio-RAD酶标仪、紫外分光光度计、台式冷冻离心机、恒温培养箱、台式高速冷冻离心机、琼脂糖凝胶电泳仪、-20冰箱、超低温冰箱、生物平安柜、移液枪等仪器和设备，为本工程的顺利开展创造了很好的条件。所需各种药品、试剂可

18、通过国内外有关公司购置，均已落实。本工程动物实验局部，已联系浙江中医药大学实验动物中心。作为浙江省医学实验动物重点学科和浙江省中医药实验动物重点实验室，其具有符合国家规定的二级实验动物和动物饲养设施，能确保实验顺利完成。工程指导老师一直致力于免疫学和分子生物学的研究工作，具备了扎实的理论知识和动手能力作为实验优势。工程组成员结构合理，精力充分，事业心强，工作认真负责，具有开展本工程研究的根本素质、丰富经验和实践技能。申请者及工程组成员已广泛地查阅了文献资料，掌握了哺乳动物红细胞免疫及CR1基因的研究资料，为本工程的研究提供了扎实的背景依据。工程组的预实验结果说明，随着年龄的增长，WHBE兔和J

19、W兔的E-C3bRR和免疫粘附肿瘤细胞能力与年龄呈显著负相关9，且老年WHBE兔红细胞免疫粘附肿瘤细胞能力显著高于日本大耳白兔P0.05，以雌性动物变化最为明显P0.05；而E-ICRR随年龄呈显著正相关。说明随着机体在衰老过程中，老龄动物由于血清补体含量降低，体内循环免疫复合物的大量堆积，引起机体体液免疫的下降，导致疾病发生的易感性增强。通过上述研究工作的开展，申请者及其工程组成员在本工程所涉及的实验兔饲养、血样采集、红细胞免疫功能评价等方面均积累了丰富的经验，为本工程的研究奠定了扎实的根底。 本工程为国内首例针对红细胞免疫功能与基因表达的相关性研究，涉及实验兔CR1基因表达产物含量的变化，

20、从基因和蛋白水平上进行相关性分析研究，这是创新之处，也是风险所在。而近期实验结果说明，实验兔免疫功能在不同发育期、不同品种间基因表达存在差异，因此，本工程研究确实可行，有助于实验兔作为动物模型用于人类相关疾病及衰老的研究。4、工程创新之处1首次对不同发育期WHBE兔和JW兔骨髓CR1基因的mRNA表达进行定量分析；2首次探索不同发育期WHBE兔和JW兔骨髓CR1基因的mRNA表达量与WHBE兔和JW兔红细胞免疫功能特性的相关性。5、工程方案目标1明确不同发育期WHBE兔和JW兔红细胞免疫功能的差异；2明确不同发育期WHBE兔和JW兔CR1基因mRNA表达量的差异；3明确WHBE兔和JW兔红细胞

21、免疫功能增龄变化与CR1基因mRNA表达增龄变化的关系。参考文献1 郭峰现代红细胞免疫学M上海：第二军医大学出版社，2002，19(2)：21-232 赵焕英，包金风实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展J中国组织化学与细胞化学杂志，2007，72：66-673 陈晔光，张传茂，陈俭分子细胞生物学M北京：清华大学出版社，2006，2：427-4384 李一经，刘宝全，李海滨马立克氏病病毒感染鸡TCR1与TCR2 T细胞动态变化观察J东北农业大学学报，1998，24)：355-3585 曹东，黄宗干，曹维西白血病患者红细胞免疫功能的研究J中华内科杂志，1988，7(10)：634 6 林森

22、国外有关红细胞CR1研究的几种测定方法M南京：南京大学出版社，19937 虞紫茜，赵中平红细胞免疫功能的初步研究J 中华医学杂志，1982，2(2)：7158 李德菊，邵华肿瘤患者红细胞免疫功能与T淋巴亚群关系的探讨M南京：南京大学出版社，1993：1819 郭峰血清对红细胞免疫粘附抑制作用的测定 J上海免疫学杂志，1987，5(7)：13310郭峰，张俊洁，赵书平，等正常人红细胞CR1密度相关基因多型性分布J上海免疫学杂志，1998，8(3)：l52 11邬伟秀，蔡敏琪，等 肿瘤患者红细胞免痤功能刮定及其影响因素的研究J中华血液学杂志，1996，7(4)：30912 Fearon DTIde

23、ntification of the membrane glyeor rotein that is the C3b receptor of the human erythrocys polymer phonuclear leukocyteB lymphocyte and monoJJ.Exp. Med.，1980，2(1)：20-3013 Xiang L，Rundles J R，Hamihon D R，et alQuantitative alleles of CRl coding sequence analysis and comparison of haplotypes in two eth

24、nic groupsJJ. hnmuno1，1999，3(9)：4939-4945三、预期成果、知识产权形成及经济、社会效益分析工程的预期成果及知识产权归属情况1明确不同发育期WHBE兔和JW兔红细胞免疫功能的差异；2明确不同发育期WHBE兔和JW兔CR1基因mRNA表达量的差异；3明确WHBE兔和JW兔红细胞免疫功能差异与CR1基因mRNA表达量间的相关性；4以论文形式提供研究成果，在国家级核心期刊上发表学术论文12篇。工程的市场前景分析CR1作为红细胞免疫功能的重要物质根底之一，测定其水平、研究其变化规律及其分子机理对了解某些疾病的病情和判定治疗反响具有重要的意义。红细胞免疫在免疫调控中占

25、有很重要的地位，是机体免疫系统重要的组成局部。现代红细胞免疫研究发现，许多疾病的发病机理中，红细胞免疫缺陷和免疫功能低下占大多数。红细胞可黏附肿瘤细胞，这种免疫黏附活性主要与红细胞上的补体受体I型(CR1)有关，在肿瘤免疫中具有重要作用。同时还发现，红细胞能产生自然杀伤(NK)细胞增强因子(NKEF)，该因子可明显增强N K细胞杀伤活性。目前对红细胞免疫功能的表现、机制、调节机制与疾病关系等的研究都取得了一定的进展，红细胞具有免疫功能已是不容质疑的事实。在临床中，肿瘤病人往往伴有贫血，同时有红细胞CR1数量与活性都下降。近年来研究证明红细胞在抗肿瘤免疫反响中有多种作用，而肿瘤病人红细胞免疫功能

26、全面紊乱与低下。现在的社会人群中，肿瘤病依然是一大块重要的难治疾病，这也正说明了红细胞免疫药物的广阔市场需求。然而，我国目前正研制的和生产的免疫药物大局部是追踪模仿国外的产品，缺少原创的技术和拥有自主知识产权的产品，更缺少增强或调控红细胞免疫功能的药物筛选及药效研究的动物模型。近年来，止血愈疡颗粒、胃痛宁胶囊、健胃愈疡颗粒等一批中药制剂在肿瘤病的治疗方面起到了积极的作用。但是，由于红细胞免疫功能病理机制极其复杂，各种药物治疗的效果亦因人而异。因此，利用最新技术研究红细胞免疫功能与基因表达的相关性，从而开发有针对性的新药仍具有广阔的市场需求。同时，通过本工程的研究，为明确WHBE兔红细胞免疫功能

27、的特性提供实验依据，为WHBE兔的培育、遗传检测和分子生物学特点的进一步研究奠定根底。有助于说明WHBE兔红细胞免疫功能特性的分子机制，为明确WHBE兔是否比JW兔、NZW兔更适于红细胞免疫相关疾病、机体衰老等的研究奠定根底，借以扩展在生物市场上的应用价值。工程的盈利能力分析对于免疫性疾病，红细胞具有重要的免疫功能，本工程的初步试验说明，CR1基因的表达量与免疫功能成正比关系，其作用途径明确，对于开发有针对性的新药有积极作用。目前市场上，并没有针对加强红细胞免疫功能的基因药物，因此，假设在本工程根底上开发新药，将具有很强的盈利空间。工程的社会效益分析对于社会上常见而难治的肿瘤病，根本上都是基因

28、突变和逐渐积累的结果，本工程从分子水平去分析阐述红细胞免疫功能与基因表达的相关性，为红细胞免疫功能对肿瘤作用的的可能鼓励提供了实验数据，推动了于红细胞免疫相关疾病、机体衰老等的研究和临床应用，具有良好的社会效益。四、工程实施进度方案2023.01-2023.02 兔血样和骨髓的采集；2023.03-2023.04 红细胞悬液的制备；2023.05-2023.06 红细胞C3b受体花环率和循环免疫复合物花环率的测定；2023.07-2023.08 红细胞免疫粘附肿瘤细胞能力的测定；2023.09-2023.10 总RNA提取和荧光定量RT-PCR检测CR1基因的mRNA表达量。2023.11-2

29、023.12 资料统计分析，课题总结，论文撰写。五、工程经费预算预算科目名称金额一、经费来源合计100001、省财政经费50002、学校配套经费50003、自筹经费04、其他0二、经费支出合计100001、设备费01购置设备费02试制设备费03设备租赁费02、材料费48003、测试化验加工费5004、燃料动力费05、差旅费12006、会议费 07、合作、协作研究与交流费5008、出版/文献/信息传播/知识产权事务费12009、人员劳务费100010、专家咨询费011、其他开支800注：支出预算按照经费开支范围确定的支出科目和不同经费来源编列，同一支出科目一般不同时在财政经费和自筹经费中预算。其中购置设备费20% 其中不能用于购置通用设备；人员劳务费15%