结直肠癌肝转移动物模型

1、结直肠癌肝转挪动物模型【摘要】目的比拟几种结直肠癌肝转挪动物模型的建立方法，确定一种比拟合适的结直肠癌肝转挪动物模型。方法以balb/鼠为研究对象，随机分组，分别经脾脏、直肠、腹腔按不同剂量(0.1l、0.2l、0.3l、1.0l)(浓度为1106个/l)注入小鼠结肠腺癌细胞(t26)悬液，其中腹腔组无1.0l剂量，卡方检验比拟三组动物模型组内及组间肝转移率。结果三种方法均能复制出结直肠癌肝转挪动物模型，脾脏组0.1l、0.2l、0.3l、1.0l肝转移率分别为50.0%、77.2%、50.0%、27.0%;直肠注射组0.1l、0.2l、0.3l、1.0l肝转移率为50.0%、53.1%、16

2、.7%、6.7%;腹腔注射组0.1l、0.2l、0.3l肝转移率为10.0%、22.2%、10.0%。结论经脾脏注射0.2l(1106个/l)balb/鼠结肠腺癌细胞株(t26)是一种建立结直肠癌肝转挪动物模型成功率较高的方法。而经肛门直肠注射0.1l或0.2l(1106个/l)balb/鼠结肠腺癌细胞株(t26)是一种建立结直肠癌肝转挪动物模型简便及符合结直肠癌肝转移规律的方法。【关键词】balb/鼠;balb/鼠结肠腺癌细胞株(t26);结直肠癌;肝转移;动物模型establishentfanialdelsinlretalanerithliveretastasisyangjianfeng,

3、zhangsen,gafeng,etal.departentfthelretalandanalsurgery,thefirstaffiliatedhspitalfguangxiedialuniversity,naning530021,hinaabstratbjetivetdefineasuitableethdfestablishinganialdelflretalanerithliveretastasisbyparingseveralethds.ethdsbalb/useseregrupedrandlyint11grupsbydsesfadenarinaellsandethdsfinjetin

4、,thatis0.1l,0.2l,0.3l,1.0l(lnadenarinaellsin1106/l)byspleen,retu,peritnealavity(n1.0ldsegrupinperitnealgrup).theratefliveretastasesereparedbeteenthethreegrupsandithineahgrup.resultsthreeethdsereabletrepliateananialdelflretalanerithliveretastases.theliveretastasisratesere50.0%,77.2%,50.0%,27.0%respet

5、ivelyin0.1l,0.2l,0.3l,1.0ldsesbyspleen;thereere50.0%,53.1%,16.7%,6.7%respetivelyin0.1l,0.2l,0.3l,1.0ldsesbyretu,and10.0%,22.2%,10.0%in0.1l,0.2l,0.3ldsesthrughperitnealavity.nlusininjetthrughspleenithadsef0.2l(1106/l)isaeffetiveaytestablishanialdelflretalanerithliveretastasis.injetthrughretuithadsef0

6、.1lr0.2l(1106/l)t26isasipleayfestablishanialdelflretalanerithliveretastasis,andfllthelafliveretastasesflretalanerals.keyrdsbalb/use;balb/ielnadenarinaellline(t26);lretalaner;liveretastasis;anialdel结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,2022年?中国卫生统计提要?示结直肠癌病死率位居恶性肿瘤第5位1。目前国内以每年4.2%的速度上升2，全世界结直肠癌的发病率以3%的速度上升3。影响结直肠癌患者预后的

7、最大问题就是肿瘤复发或转移，其中最常见的就是肝脏转移,据国外文献报道50%60%的结直肠癌患者最终会发生肝转移4。准确的研究结直肠癌在体内进展和转移情况，动物模型必不可少。本研究旨在比拟几种建立结直肠癌肝转挪动物模型的方法，为今后防治结直肠癌肝转移的研究打下基矗1材料与方法1.2试验用细胞balb/鼠结肠腺癌细胞株(t26)由美国引进，第二军医大学曹雪涛教授惠赠。1.3实验方法1.3.1常规培养t26细胞于含10%胎牛血清的rpi1640营养液。取指数生长期的细胞，消化吹打成单细胞悬液，952g(1000rp)离心5in，弃上清液，加适量不含血清的rpi1640营养液调整细胞浓度至1106个/

8、l。1.3.2脾脏注射如图1，腹腔注射1%戊巴比妥钠(40g/kg)麻醉balb/鼠，于背侧中部、左侧腋中线与腋后线间，取1.5左右切口进腹，显露脾脏，于脾脏上极沿脾脏纵轴进针，边退边注入t26细胞悬液(1106个/l)，后用蘸有络合碘的消毒棉签轻压针眼处数秒，查看无出血后，将脾脏放回原位，全层缝合腹壁。分组注射0.1、0.2l、0.3l、1.0lt26细胞小鼠各30只。根据其实验结果，0.2l组追加注射40只。1.3.3直肠黏膜注射如图2，固定balb/鼠于自制小鼠固定器，助手充分暴露肛门。于小鼠肛门的两侧壁和后壁进针，缓慢注入t26细胞悬液(1106个/l)。分组注射0.1、0.2l、0.

9、3l小鼠各22只，1.0l组15只。后追加注射0.2l组20只。1.3.4腹腔注射36只balb/鼠均分0.1l、0.2l、0.3l组于下腹部正中偏右注入t26细胞悬液(1106个/l)。观察各组小鼠生活情况及生存时间，每组因手术死亡和两周后试验性处死小鼠不计算在统计数据内，其余小鼠待其自然死亡或濒死状态开腹后观察原位肿瘤生长情况和肝脏转移情况，并取肝脏及原发肿瘤组织送病理。1.4采用spss13.0软件进展数据分析，卡方检验比拟组间、组内肝转移率差异，p0.05为差异有统计学意义。2结果2.1大体及病理观察2.1.1脾脏注射组两周后各组小鼠均有不同程度的消瘦，试验性处死2只均有脾脏种植瘤，且

10、0.3l、1.0l组可见腹腔内有大小不一的肿瘤，少量血性腹水，肝脏有不同程度增大，未见明显结节。小鼠自然死亡后解剖发现0.1l、0.2l、0.3l组小鼠中局部可见肝脏外表灰白色结节、大小不一(图3)，0.3l、1.0l组腹腔内可见多个大小不一的肿瘤，大量血性腹水。2.1.2直肠注射组小鼠术后正常饮食，两周后各组小鼠消瘦、肛门部均有不同程度的梗阻，以1.0l最严重。两周后试验性处死0.1l、0.2l、0.3l组小鼠2只可见肛门部均有种植肿瘤，肝脏未见明显结节。小鼠自然死亡后解剖发现0.1l、0.2l组小鼠中局部肝脏外表可见大小不一灰白色结节。2.1.3腹腔注射组小鼠术后正常饮食，两周后各组小鼠消

11、瘦，腹部稍膨隆，自然死亡后可见明显腹部膨隆，解剖腹腔内可见多个大小不一肿瘤，大量血性腹水。肝脏均未见明显结节。肝脏病理检查可见癌细胞聚积成团，伴有癌结节形成，内有小腺腔构造。癌细胞分化差，异型性明显，细胞呈梭形，胞质少，核大、深染且不规那么，核仁明显，核分裂像易见。与原发肿瘤形态相似，符合balb/鼠结肠腺癌细胞株(t26)的构造特征(图4)。2.2肝转移率比拟各组小鼠的肝转移率见表1。表1三种注射方法各组的肝转移率与生存期注：*1.因麻醉或操作过程中造成死亡的balb/小鼠不计算在内;2.各组两周后试验性处死的balb/小鼠不计算在内2.2.1组内比拟(1)脾脏注射组(表2)：0.1l组与0

12、.2l组比拟有差异(2=5.226，p=0.022);0.1l组与0.3l组比拟无差异。0.1l组与1.0l组比拟无明显差异(2=1.958，p=0.162);0.2l与0.3l组比拟有差异(2=5.226，p=0.022);0.2l与1.0l组比拟有明显差异(2=14.749，p=0.000);0.3l组与1.0l组比拟无明显差异(2=1.958，p=0.162)腹腔注射组肝转移率：各剂量组比拟均无明显差异(2=0.780，p=0.677)。表2脾脏注射组内肝转移率比拟(2)直肠注射组(表3)：0.1l组与0.2l组比拟无明显差异(2=0.048，p=0.826);0.1l组与0.3l组比拟

13、有差异(2=4.677，p=0.031);0.1l组与1.0l组比拟有明显差异(2=7.468，p=0.006);0.2l组与0.3l组比拟有差异(2=6.380，p=0.012);0.2l组与1.0l组比拟有明显差异(2=9.328，p=0.002);0.3l组与1.0l组比拟无明显差异(2=0.786，p=0.381)。表3直肠注射组内肝转移率比拟2.2.2组间比拟脾脏注射组0.2l(1106个/l)组与直肠注射组0.1l(1106个/l)组、0.2l(1106个/l)组肝转移率比拟差异有统计学意义(2=7.700，p=0.021)。3讨论3.1脾脏注射1984年kzlskij等5提出建立

14、结直肠癌肝转挪动物模型的最正确途径是经脾脏注射。脾脏注射包括保存脾脏注射法和不保存脾脏注射法，不保存脾脏注射法特点是肝转移瘤形成的同时没有合并脾脏肿瘤，能较好地模拟临床上大肠癌根治术后肝转移征象，且转移率高。但操作较复杂，对试验者技术要求较高;而保存脾脏虽有脾脏肿瘤形成，但保存了脾脏的局部免疫功能，保存了宿主固有的抗肿瘤免疫功能6，7。因此，本实验选用保存脾脏注射法建立肝转挪动物模型。国内外脾脏注射t26细胞建立肝转移模型的细胞数量没有统一标准，大体上从0.5105个至1107个不等，本实验在总结前人经历的根底上，选用0.1106个至1106个中的四个剂量。本研究发现经脾脏注射0.2l(110

15、6个/l)t26细胞组肝脏转移率最高(77.2%)，与其它剂量组比拟差异有统计学意义。细胞剂量的多少直接影响着肿瘤转移的机率，肿瘤细胞剂量小，移植瘤不容易成活;而细胞剂量过大，那么会引起肿瘤失控生长8。本组肝转移率最高为77.2%，与文军宝9、范应方10等人报道有出入，但与国外ernera、lentea等报道11，12是大致相符的。出现此种差异的原因一方面是个各实验人员操作技术程度的不同;另一方面也可能是确定肝转移的方法不同，有文献报道，pr法检测肝脏肿瘤细胞的敏感度比一般的组织学检查高1001000倍13。陈路等14报道，裸小鼠原位接种人结肠癌细胞后46周就可以利用pr法在肝脏中检测常规病理

16、学检查无法的发现微转移的肿瘤细胞。3.2直肠注射如何才能更好地复制临床结直肠癌发生肝转移的过程，一直是建立此动物模型中非常重要的问题。为此，国内外采用开腹盲肠肠壁种植，根本上使用的动物都是裸鼠。刘秋珍等15应用裸小鼠亦用此法将lv细胞1106个种植于盲肠壁，肝转移率达100%，但未提及其生存时间多少。而thalheiera等16将人结肠癌细胞ht29原位注入裸小鼠大肠结果发现肝转移率为89%,bresalier等17将不同种类的人结肠癌细胞0.2106个注入裸鼠盲肠壁，转移率根据细胞的不同为12.5%80.0%。开腹盲肠肠壁种植法要务实验室的无菌条件和实验者操作才能高，且不易大批量操作。开腹注

17、射盲肠壁细胞剂量在1106个左右，但是经肛门注射细胞剂量未见报道，我们也曾经注射1107个t26细胞于balb/小鼠5只直肠肛门部，结果小鼠均在注射后2周内因直肠肛门部梗阻死亡，解剖后肝脏大体和病理无任何改变。因此，本试验选用注射细胞剂量为0.1106个1106个。本实验直肠注射组0.2l(1106个/l)t26细胞株组肝脏转移率最高(53.1%)，与0.1l(50.0%)组差异无统计学意义，但与其余两组差异有统计学意义，原因可能在于0.3l组、1.0l组细胞剂量较大，注射肿瘤细胞增殖快，造成了小鼠肠梗阻，缩短了小鼠的生存时间，影响了肝转移率。另外，肠梗阻致使小鼠的营养状况更差，这在某种程度上

18、也可能影响了小鼠的肝转移率。3.3腹腔注射本实验还进展了腹腔注射，旨在研究本实验应用的t26细胞株的高转移性，但因为腹腔内出现广泛的移植瘤，癌性腹水严重，大量的肿瘤细胞增殖可能引起体内巨噬细胞及nk细胞的增殖，降低了肝脏转移率。3.4组间比拟脾脏注射t26细胞株0.2l(1106个/l)组与直肠注射0.2l(1106个/l)肝转移率比拟差异有统计学意义(p=0.021)。可能是由于从脾内种植细胞，植入的细胞可以逃逸大量活化的、能分泌肿瘤坏死因子(tnf)的吞噬细胞及nk细胞的攻击，从而更容易发生血管浸润、肝转移18。3.5实验心得在实验过程中，我们发现：(1)脾脏注射切口要足够长，从脾脏上极沿脾脏纵轴进针，缓慢注射，完毕后用络合碘棉球杀灭溢出的肿瘤细胞。(2)直肠注射时，自制的小鼠固定器可以很好的固定小鼠并能帮助助手扩张肛门