分子标记技术20091课件

1、分子标记技术Molecular Marker Technology 分子标记技术课程安排一、分子标记技术概述 (3)二、DNA的提取、PCR优化与克隆 (3)三、显性分子标记技术 (ISSR、AFLP) (6)四、共显性分子标记技术(RFLP、SSR) (6)五、分子标记数据的读取方法与分析 (3)六、序列测定与分析 (3)文献讨论 (6-12) 周延清(编著). 2005. DNA分子标记技术在植物研究中的应用. 北京：化学工业出版社 郑成木主编. 2003. 植物分子标记原理与方法. 长沙：湖南科学技术出版社 邹喻苹,葛颂,王晓东等.2001.系统与进化植物学中的分子标记.北京:科学出版社

2、 Caetano-Anolles G & Gresshoff P M (eds) . 1998. DNA Markers: Protocols, Applications, and Overviews. New York: Wiley-Vch Press. 王中仁. 1996. 植物等位酶分析. 北京：科学出版社参 考 资 料一、分子标记技术概述形态标记Color: yellow vs white etcTexture: smooth vs rough etcShape: round vs irregular etc 遗传标记原用于遗传作图，确定染色体上基因顺序（gene mapping） 1

3、913年，Alfred H. Sturtevant 使用六个形态标记构建了第一个果蝇遗传图谱 1923年，Karl Sex发现菜豆数量性状（种子颜色和大小）和数量性状位点之间的遗传连锁 （QTL）细胞学标记核型分析 (karyotype analysis)染色体显带 (chromosome banding) 分子标记 或蛋白质序列（大小）(狭义的) 指基于DNA分子序列的标记(广义的) 指可遗传的、且可检测到的DNA序列是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记 分子标记是能反映生物个体或种群间基因组中某些差异特征的DNA片段 分子标记（molecular marker）技术产生的原因：（形态

4、性状的局限） 基于形态的遗传标记（形态标记）发展到同工酶又到DNA分子标记 DNA分子标记在分子生物学的发展过程中诞生和发展，它能够直接反映基因组DNA间的差异* DNA或cDNA等分子水平上的多态性检测技术* 能提供分子标记的分子生物学技术分子标记技术First Generation: 1980s -Based on DNA-DNA hybridizations, such as RFLP.Second Generation: 1990s -Based on PCR: Using random primers: RAPD, DAF, ISSR. Using specific primers:

5、 SSR, SCAR, STS -Based on PCR and restriction cutting: AFLP, CAPs.Third Generation: recently -Based on DNA point mutations (SNP), can be detected by SSCP, DNA chip, sequencing etc.酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）Molecular Markers Classes 1974年，Grozdicker等人首创了DNA分子标记，即第一代DNA分子标记：

6、限制性片段长度多态性标记 （RFLP） 1982年，Hamande发现了第二代DNA分子标记：简单序列重复标记（SSR） 1990年，Williams和Welsh等发现了随机扩增多态性DNA标记（RAPD） 1993年，Zebeau和Vos发明了扩增片段长度多态性标记（AFLP） 1994年，Zeitkiewicz等等发明了简单重复见序列标签（ISSR） 1998年，第三代DNA分子标记SNP诞生 随后，大量的分子标记技术被发展了起来宏观微观个体居群生物群落组织细胞分子生态系统器官分子标记的特点对理想的遗传标记的要求：具有高的多态性 共显性遗传（鉴别二倍体中杂合和纯合基因型）能够明确辨别等位基

7、因 分布于整个基因组中 选择中性（即无基因多效性） 检测手段简单快速（如实验程序易自动化） 开发成本和使用成本尽量低廉 在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换） DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现 基于DNA分子标记的分子标记技术大致可分为五大类分子标记技术的类型1）以Southern杂交为基础的分子标记技术 限制性内切酶片断长度多态性标记（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 单链构象多态性RFLP（sing strand conformation polymorphism-RFLP, SSCP-RFLP） 变性梯度凝胶电泳R

8、FLP（denaturing gradient gel electrophoresis-RFLP，DDGCE-RFLP） 原位杂交（in situ hybridization）2）以PCR为基础的分子标记 随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA, RAPD） 序列标记位点（sequence tagged site, STS） 序列特征化扩增区域（sequence characterized amplified region, SCAR）技术 随机引物PCR（random primer-PCR, RP-PCR） 任意引物PCR（arbitrar

9、y primer-PCR, AP-PCR） 寡核苷酸引物PCR（oligo primer-PCR, OP-PCR） 单链构象多态性PCR（single strand conformation polymorphism-PCR, SSCP-PCR）什么是STSs：即序列位置标签（Sequence Tagged Site）是指一小段DNA片段（200500个碱基对），它的精确位置和碱基顺序已经明确的。由于每个STS都是唯一的，一对唯一的PCR引物对应一个STS，通过PCR反应中也可以检测出STS来，STS适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA的方向和特定序列的相对位置。ETS是cDNA

10、上的STS。NCBI建有STS数据库，既可以查询STS,也可以提交，url: /dbSTS/index.htmlDefinition in English: Short tagged tracts of DNA sequence (200 to 500 base pairs) that is operationally unique and has a single occurrence in the human genome. Their location and base sequence are known and therefore they can be used as landma

11、rks in genome mapping. They can be detected by the polymerase chain reaction in the presence of all other genomic sequences). Sequence-tagged sites are useful for mapping the sequence data reported from different laboratories and provide a framework for the physical map of the human genome. The over

12、whelming advantage of sequence-tagged sites over mapping landmarks defined through other methods is that the method can be completely described as information in a database. Expressed sequence tags are sequence tagged sites derived from cDNAs. 网络资料 小寡核苷酸DNA分析（small oligo DNA analysis, SODA） DNA扩增指纹技

13、术（DNA amplification fingerprinting, DAF） 扩增片断长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP） 相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism, SRAP） 靶位区域扩增多态性（target region amplified polymorphism, TRAP） 插入/缺失多态性（insertion/deletion polymorphism, InDel 或I/D）RAPD 原理示意图DNA提取选择随机引物PCR反应凝胶电泳图谱分析RAPDA

14、FLPGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAPCRABCSSRISSR（inter-simple sequence repeat）-CACACACACACACACACACACA-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-CACACACACACACACACACACACACACACACACA-5锚定引物5锚定引物NNNN(CA)nNNNN(CA)nNN(CA)nNN(CA)n3锚定引物3锚定引物-3锚定引物的PCR产物CACACACACACACACA-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

15、GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-CACACACACACACACACACACACACACA5锚定引物的PCR产物简单重复序列间区cDNA 文库ESTRACE公共数据库全长cDNA克隆电脑克隆基因表达谱分析5）以 单核苷酸多态性为基础的分子标记技术 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP） 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 DNA分子标记多态性的产生有其分子的基础 生物个体在DNA水平上的差异（或多态）是DNA分子标记能进行检测和分析的基础 DNA分子标记多态性的原理Point Mutation at

16、restriction sites (RFLP, CAPS, AFLP) or PCR primer sites (RAPD, DAF, AP-PCR, SSR, ISSR)B. Insertion or deletion between restriction sites (RFLP, CAPS, AFLP) or PCR primer sites (RAPD, DAF, AP-PCR, SSR, ISSR)C. Changes in the number of repeat unit between restriction sites or PCR primer sites: SSR, V

17、NTR, ISSRD. Mutations at single nucleotides: SNPPolymorphism of DNA Markers根据DNA标记产生的方式也可以对所有标记进行简单的归类：Comparison among genetic markersDNA分子标记技术具有诸多优点广泛应用： 植物分子遗传图谱的构建 植物遗传多样性分析与种质鉴定 重要的农艺性状基因定位与图位克隆 转基因植物鉴定和分子标记辅助选择育种 取得惊人的成绩，具有广阔的应用前景成 绩 考 核精读1或多篇用分子标记技术探索某一科学问题的有影响的文章，写一篇评述。题目自拟，制成A3正反面海报(相当于A4纸， 4页), 字号自定。内容包括：作者（如Fritsch et al.)、年份、文章标题，期刊、卷、起止页码摘要研究背景 （1）相关研究进展 （2）科学问题是什么？研究方法 使用何种分子标记技术？是否结合其他方法？研究结果与分析 简明扼要，文字以5段左右为宜，要求能说明问题的