分子杂交课件

1、转基因水稻外源基因拷贝数检测第二部分：分子杂交Southern BlottingDNA抽提DNA酶切酶切产物电泳转膜烘膜预杂交探针准备及标记杂交洗膜/显影1212345679(kb)12335转基因植物拷贝数检测实验原理Hind IIIprobe酶切、转膜杂交、显影不同的插入拷贝产生不同大小的杂交带HHHH植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法）保证核酸一级结构的完整性。（3050KB）排除其它分子的污染不存在对工具酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。其它生物大分子的污染应降到最低程度。DNA纯化的要求分离纯化核酸总的原则操作步骤：采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉； 取

2、约0.4g左右细粉于1.5ml离心管，加入1ml预热至95C以上的1.5CTAB，混匀； 65C水浴中放置30分钟，每隔5分钟上下颠倒混合数次 (DNase变性，促进内溶物释放)； 12000g离心2分钟； 吸取600l上清于新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色； 12000g离心5-10分钟；吸取450l上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95乙醇和1/10体积3M NaAc，轻轻的上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现12000g离心10分钟；弃去上清。用500l 75乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，12000g离心5分钟，弃上

3、清,自然干燥；加入50lTE（含20g/ml RNaseA），放于4C溶解；充分溶解后，测定并调整浓度1尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的-ME处理2研钵预冻，粉末转管前至加CTAB前不要融化324:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，氯仿的操作要在通风柜中进行4实验操作戴手套 思考： （1）试分析DNA降解的可能原因 （2）提高DNA产量的措施本实验注意事项： 氯仿/异戊醇（24:1）：氯仿是有机溶剂，去除植物色素，蛋白质和多糖等，异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。DNA沉淀：无水或95的乙醇，异丙醇3M NaAC (

4、或10M NH4AC） 协助乙醇沉淀DNA。75% 乙醇去除微量Na+、K+、Mg2+等阳离子及小分子量的有机分子，洗脱CTAB所用到的试剂及作用TE（1mM EDTA，10mM Tris.HCl pH8.0）溶解并长期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二价阳离子，从而抑制DNase等的活性。1.5 CTAB CTAB 15 g 1 M TrisCl (pH 8.0) 75 ml 0.5 M EDTA 30 ml NaCl 61.4 g Add ddH2O to 1000 ml 外环境条件：pH8.0防止脱氨作用；65 CTAB中DNase变性，促进内溶物释放；离心时15以防CTAB

5、沉淀而降低DNA量。DNA纯度：吸光值检测：检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.81.9； 1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有RNA。电泳检测DNA大小：琼脂糖凝胶电泳DNA质量检测琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 在pH值为8.08.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核

6、酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。实验原理：DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)电泳缓冲液的组成及其离子强度：影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶

7、并导致DNA变性，一般采用1TAE，0.5TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0） 实验步骤：用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；调整好梳子的高度；称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；将电泳样品与上样缓冲液混合后将样品依次点入加样孔中；将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。电泳指

8、示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 1. 含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中2. 含有电泳指示剂，以指示电泳的进程上样缓冲液：实验室常用核酸染料EBGel red（UniRed）/Gel greenSybr green ISybr Green II（RNA）Gold View有特定的识别序列 ，通常为46碱基的回文对称序列。切割位点位于识别序列内的固定位置上，切割后在5末端有磷酸基团，3末端有羟基。切割后形成粘性末端或平

9、末端，前者又分为3突出端（如PstI）和5突出端(如EcoRI)两种其活性发挥只需Mg2作辅酶。II类限制性内切酶的特点限制酶的一个活性单位（1U）：原则上指在50l 反应体系中，37下，经过1小时的反应将1 g的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制酶在某些极端非标准条件下对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：注意注意阅读商家提供的产

10、品说明书，了解所使用工具酶的浓度和最适作用条件，不要用错了buffer和作用的温度等涉及到酶的操作时,一律在冰上操作使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液面吸取如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制成mixture再分装各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心检测DNA质量测量DNA浓度所有DNA样品的浓度调整到大致相同限制性内切酶操作准备：DNA ( g) 10 l10*buffer reaction 2 lEnzyme (10U) 1l (10U/l ) H2O 7 l 20 l酶切体系：注意：冰上操作 1 5 DNA10 l (ddH2O) Hind (10U/l)1 l

11、5 l 10buffer2 l 10l ddH2O 7 l 35 l Total 20 l 37C 酶切过夜酶切体系混匀分装电泳检测酶切效率：每样品1/10量上样，电泳检测。若呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则重做 。出现切烂：DNA降解，重新提DNA；切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化。酶切效果检测：A1优总DNA A2劣总DNA B1 酶切烂 B2酶切优 B3切不动总DNA酶切电泳检测1212345679(kb)12335酶切反应的终止加入终浓度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应多数酶在65C 10分钟可被不可逆灭活，少数65C不失

12、活的酶在75 C 15分钟也能失活若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化造成DNA酶切不完全的主要原因有：操作不当，酶或DNA加至管壁上，反应体系没完全混合；混和后应短暂离心；反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适；酶的活力不够DNA不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；DNA样品中抑制酶活的污染物主要有：DNA 样品中的蛋白质、多糖、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性解决办法：增加酶作用的单位数（10-20U/g DNA)增大反应体积以稀释可能的抑制剂延长反应时间消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5m mol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结

13、合带负电荷的污染物。纯化DNA胶浓度0.7-0.8%。胶厚度 5mm (250ml胶)。胶的均一性(不同样品的迁移率一致)。样品DNA量指示剂量稍大，长时间指示。点样顺序：marker，阳性对照，阴性对照，本组样品电泳电压：大电泳槽40V，12小时，1-1.5V/cm。电泳结束，指示剂约移动10-11cm。电泳转膜的方式：1. Upward Capillary Transfer (Figure 1)2. Downward Capillary Transfer (Figure 2)3.Simultaneous Transfer to Two Membranes4. Electrophoretic

14、 Transfer5.Vacuum Transfer转膜Upward Capillary TransferUpward Capillary TransferDownward Capillary Transfer尼龙膜：高强度，不易破损，与DNA共价结合，反复使用10次以上不破损，不丢失DNA，吸附DNA每cm2比硝酸膜多5倍，50bp有效杂交。硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失DNA，不能与膜结合。转移缓冲液（transfer buffer）DNA转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过EB染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作 转膜时间（duration of transfer，12hrs）取决于毛细吸附系统胶厚度(5mm)及浓度(1%)大小：分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小，碱转hrs大部分结合到膜。尼龙膜（带正电荷的）具有较大的DNA结合容量，它能够吸附变性DNA，核酸能够