流式基础原理精品课件

1、流式基础原理第1页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五流式基本概念第2页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五流式细胞术的基本概念流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。第3页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五流式细胞术的特点检

2、测速度快，分析样本量大：在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟成千上万个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个 可同时分析单个细胞的多种特征：使用不同荧光素标记的单克隆抗体或荧光染料对细胞进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确强大的分选功能：在分析的同时可以对特定群体加以分选第4页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五流式检测的样本可检测的样本种类多样：各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞）

3、，微生物，人工合成微球等New!血清、血浆、培养上清、细胞裂解液样本制备：单细胞悬液（天然，机械研磨/消化）51051107cells/ml，约0.51ml，300目筛网过滤第5页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五流式细胞仪的检测范围 细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量 细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位 第6页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五流式细胞仪的检测信号第7页，共50页，2022年，5月20

4、日，1点29分，星期五散射光信号 当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束 方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为 侧向角散射光信号（SSC）。第8页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五散射光信号Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source前向角散射光（FSC, Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter

5、）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性第9页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五前向角散射光信号第10页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五侧向角散射光信号第11页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后） 颗粒杂质、气泡对检测的影响第12页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五荧光信号使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量第13页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五荧光样本制备双色直接染色第14页，共50页，2022年，5

6、月20日，1点29分，星期五荧光素的激发和发射光谱任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission，Em）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max荧光素的使用：选择正确的激光器确定所需探测器（PMT）区别488nm 520nm异硫氰酸荧光素（FITC）第15页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五光学系统：滤光片如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢

7、？滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围 Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP)460 500 540460 500 540460 500 540SP 500LP 500BP 500/50第16页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五FACSCalibur光学滤片检测器组（激光器）PMT位置带通/长通透镜适用染料488nm蓝色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE, PIFL3670 LPPerCP,PerCP-Cy5.5, PE-Cy7635nm红色激光FL4661/16APC第17页，共50页，2022年，5

8、月20日，1点29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第18页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第19页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第20页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第21页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第22页，共50页，2022年，5

9、月20日，1点29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第23页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer 第24页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五流式数据分析形式第25页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五数据存储FCS 2.0格式常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储FITC/PE双染样本第26页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五第27页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五数据显

10、示直方图（Histogram）二维点图（Dot Plot）等高线图（Contour Plot）密度图（Density）三维图（3D Plot）等第28页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五单参数直方图分析 荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了？ 荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了具有此种荧光强度的细胞在样本中所占比例的相对多少，而非绝对数目第29页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五双参数散点图分析第30页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五等高图和密度图第31页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五流式细胞仪的组成和工作

11、原理第32页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五第33页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。第34页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号第35页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五电子系统：荧光信号和散射光信号经

12、二极管和PMT接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以列表模式存储，最终以图形形式呈现第36页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五第37页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五流式对照的设置第38页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五荧光染色对照的设置1阴性对照空白对照自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强实验样本特异荧光，即抗

13、体F(ab)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光自发荧光特异荧光非特异荧光同型对照（自发荧光非特异荧光）合适？第39页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五同型对照同型对照（Isotype Control） ：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 （即Fc段相同， F(ab)2段不同）与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度 但由未免疫动物血清纯化而来用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色例如，标记F

14、ITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（1）和IgG2a（ 2a），并分别标记FITC和PE第40页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五商业化荧光素的发射光谱spectral overlap第41页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五Fluorescence Spectrum Viewer spectral overlap如何解决？第42页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五荧光染色对照的设置2补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱

15、重叠时）荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号已染色样本？真双阳？假双阳？第43页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五荧光染色对照的设置2补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时）荧光补偿（compensation）使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色 几色分析需要制备几个补偿对照管分析类型管功能 加入的抗体双色分析1Isotype1-FITC2a-PE2Compensation1A-FITC2a-PE3Compensation21-FITCB-PE4Sample1,2A-FITCB-PENo.AntibodyIsotypeMouse anti-human未免疫Mouse血清纯化而来1A-FITC（1）1-FITC2B-PE（2a）2a-PE第44页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五双色荧光补偿1 FL1单染补偿管第45页，共50页，2022年，5月20日，1点29分，星期五双色荧光补偿2 FL2单染补偿管第46页，共50页，2022年，5月20日，