对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态中作用的研究

1、对小鼠黑色素移植瘤血管生成拟态中作用的研究张凡孙保存常永霞赵秀兰【摘要】目的：利用小鼠移植瘤模型动态观察D31、P2、P9、athepsinD在恶性黑色素移植瘤血管生成拟态形成中的作用。方法：采用B16黑色素瘤细胞株制作小鼠恶性黑色素移植瘤动物模型，成瘤后根据随机数字表每天随机抽取一只小鼠处死，共12d，获得肿瘤样本114例；HE染色、D31、athepsinD、P2、P9、HB45免疫组织化学染色和PAS染色；分别计数血管生成拟态周围及远离血管生成拟态区域肿瘤细胞中阳性细胞百分率；内皮依赖性血管周围及远离内皮依赖性血管区域肿瘤细胞中阳性百分率；连续计数10个高倍视野并取其均值。结果：在恶性黑

2、色素移植瘤形成的第18天，肿瘤组织内存在血管生成拟态；第912天移植瘤中的血管生成拟态被内皮依赖性血管替代；血管生成拟态周围肿瘤细胞中D31、P2阳性细胞百分率高于远离血管生成拟态区域的阳性细胞百分率;内皮依赖性血管周围肿瘤细胞D31阳性细胞百分率与远离内皮依赖性血管区域的阳性细胞百分率之间存在明显差异；血管生成拟态周围肿瘤细胞P9阳性细胞百分率高于内皮依赖性血管周围的阳性细胞百分率；血管生成拟态密度与血管生成拟态周围肿瘤细胞D31、athepsinD、P2阳性细胞百分率之间存在相关，与肿瘤细胞中P9阳性细胞百分率之间不存在相关；内皮依赖性血管密度只与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞中D31阳性百分

3、率之间存在相关，与athepsinD、P9、P2之间不存在相关。结论：恶性黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态与内皮依赖性血管共存，且与内皮依赖性血管之间存在一定的时空变化规律。D31、athepsinD、P2、P9、HB45等参与了黑色素瘤血管生成拟态的形成，其中D31、P2作用尤其重要。【关键词】血管生成拟态;肿瘤血管生成;细胞粘附分子;恶性黑色素瘤;基质金属蛋白酶【KEYRDS】Vasulgeniiiry;Angigenesis;elladhesinleule;alignantlena;atrixetallprtEinase血管生成拟态是1999年美国las大学的anitis和Flberg等根据

4、他们对眼葡萄膜恶性黑色素瘤微循环的研究结果，发现的一种与传统的肿瘤血管生成途径完全不同的、不依赖内皮细胞的全新的肿瘤细胞的血液供给方式16。恶性黑色素瘤细胞通过自身变形和与细胞外基质互相作用，模拟血管壁构造形成可输送血液的管道，从而重塑肿瘤的微循环，并且与宿主血管相连通，使肿瘤获得血液供给，命名为血管生成拟态。这种特殊的肿瘤血供形式与内皮依赖性血管的生成在很多方面存在不同。研究证实具有血管生成拟态的肿瘤恶性度高，生长迅速，易发生血道转移。本研究在以前实验的根底上首次提出了血管生成拟态的时空变化概念：即血管生成拟态是肿瘤血液供给的一种暂时性替代形式，在肿瘤发生开展的一定时期内存在，在肿瘤的不同区

5、域存在不同的变化趋势。本研究的前期实验通过小鼠的恶性黑色素移植瘤模型，初步验证了我们提出的假说。本实验利用免疫组织化学方法对血管生成拟态的形成机制以及与内皮依赖性血管之间的联络做进一步的讨论，深化提醒两者之间的变化规律。1材料和方法1.1实验动物：57小鼠购自北京军事医学科学院动物室，68周龄，共20只，雌雄各半，体重2530g，编号后干净实验室饲养，饮用水和饲料由天津医科大学实验动物中心提供。1.2实验方法：先将黑色素瘤细胞株B16复苏，1640细胞培养基上培养6d，使细胞排满瓶底，0.2%胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度到达1107/l。75%酒精消毒小鼠鼠蹊部，每只小鼠鼠蹊部皮下注射0

6、.2l细胞悬液。10d后接种部位开场出现皮下肿块。根据随机数字表每天抽取一只小鼠处死，共持续12d。解剖并仔细检查动物全身，共获得肿瘤样本114例。全部标本均经10%福尔马林固定，然后常规石蜡包埋。1.3染色方法1.3.1试剂：一抗D31、HB45为鼠抗小鼠单克隆抗体，即用型，6l包装，SNATARUZ消费，进口分装；athepsinD、P2、P9兔抗多克隆抗体，浓缩型，0.1l包装，购自武汉博士德试剂公司；二抗、三抗为SP复合物和山羊抗兔PV6001，购自北京中山试剂公司。PAS液为天津肿瘤医院病理室自行配制。1.3.2主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶

7、，PBS缓冲液振洗，抗原微波热修复，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗、三抗各1hDAB显色1015in，复染核脱水透明，中性树胶封片。1.3.3D31、PAS双重染色：先挑选2例正常胃粘膜样本进展对照染色，分泌粘液处均染成樱桃红色，证实PAS试剂质量可靠。先按照SP法进展D31免疫组织化学染色，DAB显色后显微镜下观察，待血管内皮细胞着棕黄色后水冲数分钟终止显色，然后用0.5%高碘酸溶液复原切片10in，时间切不可过长以防止出现假阳性结果。水流冲洗数分钟后置于shiff液中，避光1015in，自来水冲洗，显微镜下观察出现樱桃红色，苏木素浅染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝后，梯度酒精脱水，二

8、甲苯透明，中性树胶封片。1.4计算机图象处理使用空军总医院医学工程研究所的BINDAFIG图象采集处理系统计算每张切片中坏死面积。1.5计数方法1.5.1区域划分：中央区与外周区的划分：避开肿瘤坏死,将每张切片中肿瘤组织镜下视野均匀分成三等份，即内1/3、中1/3、外1/3三个区域，内1/3区域即为中央区，外1/3即为外周区。血管生成拟态周围与远离血管生成拟态、内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的划分：以血管生成拟态、内皮依赖性血管为中心的高倍视野定义为血管生成拟态、内皮依赖性血管周围；间隔 上述视野一个高倍视野的肿瘤细胞即为远离血管生成拟态和内皮依赖性血管。血管生成拟态判断标准：无内皮细

9、胞衬复的PAS阳性管道、衬复PAS阳性物质的肿瘤细胞围成不规那么管腔，且管腔内存在红细胞，周围没有出血坏死和炎症细胞浸润。1.5.2计数方法：低倍镜下找到血管生成拟态和内皮依赖性血管存在的典型区域，换成高倍镜400，连续计数10个高倍视野内的血管生成拟态、内皮依赖性血管，取其均值即为血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度。同时计数血管生成拟态周围、内皮依赖性血管周围、远离血管生成拟态、远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞中各种指标阳性细胞数各项指标均连续计数10个高倍视野，每个视野内随机计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其均值。1.6统计学处理：2结果2.1常规形态学观察肿瘤直径1.54，大体为黑色

10、，外表可见丰富的血管，与周围宿主组织分界不清，呈浸润生长，切面呈黑红色,实性、质地柔软有光泽，部分区域散在出血坏死。可见肿瘤细胞围成的不规那么的管腔，腔内可见红细胞，即血管生成拟态，而且与内皮依赖性血管共存现象，共26例。内皮依赖性血管多位于移植瘤外周区并与正常组织相交界。中央区血管生成拟态较多见，外周区血管生成拟态较少。早期肿瘤坏死较少，且多为点状坏死、局灶性坏死，后期肿瘤组织中央出现区域坏死，将肿瘤组织分割成多个孤立的细胞巢。2.2肿瘤组织内的血管生成拟态的形态学特点通过D31和PAS双重染色，在该移植瘤的第18天可见到典型的血管生成拟态样构造：外层为D31染色阴性的肿瘤细胞，内衬樱桃红色

11、的PAS阳性物质，管腔内有成堆的红细胞,这种构造在第912天被内皮依赖性血管所替代。我们的实验中还发现有的血管生成拟态中肿瘤细胞围成的不规那么管腔内无PAS阳性物质衬复，同时管腔内存在红细胞。我们以前实验证实人恶性黑色素瘤细胞能表达内皮细胞抗原D31和PAS阳性物质。本实验中也发现类似现象,镜下观察可发现D31抗原位于肿瘤细胞胞浆内，呈均质或细颗粒状,且呈现高表达。PAS阳性物质那么呈颗粒状或团块状分布在肿瘤细胞胞浆内，甚至有的单个肿瘤细胞外周有一层PAS阳性物质环绕，或几个肿瘤细胞外有一圈PAS阳性物质。2.3各种指标在肿瘤不同区域的表达变化规律2.3.1D31在肿瘤不同区域的表达显微镜下观

12、察发现部分的肿瘤细胞表达D31抗原，同时围成血管生成拟态的肿瘤细胞不表达或极少表达D31抗原，血管生成拟态周围的肿瘤细胞高表达D31抗原。统计学分析显示：血管生成拟态周围的肿瘤细胞D31的表达高于远离血管生成拟态肿瘤细胞的表达，内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的D31表达高于远离内皮依赖性血管肿瘤细胞的表达，血管生成拟态周围肿瘤细胞D31的表达与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表达之间差异无统计学意义见表1。表1D31在肿瘤不同区域的表达个/高倍视野区域肿瘤数中位数ZAsypsig血管生成拟态周围区262.56.1910.001远离血管生成拟态区261.55.4390.003内皮依赖性血管周围区1143.

13、03.1500.250远离内皮依赖性血管区1141.72.3.2P2在肿瘤不同区域的阳性表达血管生成拟态周围肿瘤细胞P2表达高于远离血管生成拟态的肿瘤细胞的表达；内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞P2的阳性表达之间差异无统计学意义，血管生成拟态周围肿瘤细胞P2的表达与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表达之间差异无统计学意义见表2。2.3.3P9在肿瘤不同区域的表达血管生成拟态周围肿瘤细胞与远离血管生成拟态肿瘤细胞P9的表达之间差异无统计学意义，内皮依赖性血管与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞的P9表达之间差异无统计学意义，血管生成拟态周围的肿瘤细胞P9的阳性表达高于内皮依赖性血管周围肿瘤细

14、胞的表达见表3。2.3.4athepsinD在肿瘤不同区域的阳性表达血管生成拟态周围肿瘤细胞与远离血管生成拟态的肿瘤细胞athepsinD的表达差异无统计学意义，内皮依赖性血管周围与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞athepsinD表达差异无统计学意义，血管生成拟态周围的肿瘤细胞athepsinD的表达高于内皮依赖性血管周围的肿瘤细胞的表达见表4。表2P2在肿瘤不同区域的阳性表达个/高倍视野表3P9在肿瘤不同区域的阳性表达个/高倍视野表4athepsinD在肿瘤不同区域的阳性表达个/高倍视野2.4血管生成拟态密度与血管生成拟态周围肿瘤细胞各免疫组化指标之间的相关分析表5血管生成拟态密度与周围肿瘤细

15、胞阳性表达的相关分析从上表我们可以看出血管生成拟态密度与其周围肿瘤细胞D31、P2的阳性表达之间存在亲密相关，与其周围肿瘤细胞athepsinD、P9的阳性表达之间不存在相关。2.5内皮依赖性血管密度与周围肿瘤细胞各免疫组化指标之间的相关分析从下表可以看出，内皮依赖性血管密度与其周围肿瘤细胞D31表达之间存在相关，与其它指标之间不存在相关见表6。表6内皮依赖性血管密度与周围肿瘤细胞阳性表达的相关分析2.6血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度和肿瘤坏死之间的关系显微镜下观察我们可以看到，早期肿瘤组织内血管生成拟态密度较高，坏死较少见，多为小灶性坏死，后期肿瘤组织内血管生成拟态密度降低，坏死逐渐增

16、多，且多为片状坏死，统计学分析显示，血管生成拟态密度与肿瘤组织的坏死之间存在相关，相关系数r=-0.978，内皮依赖性血管密度与肿瘤坏死之间亦存在相关，相关系数r=-0.230，证明在该肿瘤中血管生成拟态对维持肿瘤生长起到重要作用见表7。表7血管生成拟态密度、内皮依赖性血管密度与坏死之间的相关3讨论血管生成拟态是一种全新的、没有内皮细胞参与的肿瘤血液供给形式，已有的研究证实多种肿瘤炎性乳癌、浸润性卵巢癌、前列腺癌中存在血管生成拟态。同时研究发现由于这些肿瘤血液供给的特殊性，可以便利克制肿瘤快速生长过程中的缺血、缺氧状况，恶性程度高、生长迅速、极易发生血道转移，因此深化研究血管生成拟态的分子机制

17、对上述肿瘤的抗血管治疗具有重要意义。我们的研究中发现血管生成拟态只是在恶性黑色素移植瘤的一段时期内与内皮依赖性血管共存，说明该构造是一种暂时性的血液供给形式，与内皮依赖性血管之间存在一定的演变规律，我们首次提出了血管生成拟态的时空变化概念，前期实验部分验证了我们的假说。肿瘤血管形成是在多种促血管生成因子的刺激下，肿瘤血管生成开关机制失衡，内皮细胞由静止转化为活化状态，打破基底膜，降解细胞外基质，增生形成内皮细胞条索，然后通过基质重塑形成完好的血管网。血管生成拟态那么是肿瘤细胞利用自身的变形，模拟内皮细胞互相连接粘附，并与细胞外基质互相作用，借助多种蛋白酶的作用使部分细胞外基质重塑，形成由肿瘤细

18、胞彼此连接的不规那么管腔，我们实验中的PAS染色有力的证明肿瘤细胞模拟内皮依赖性血管的构造。尽管两者形成的机制有所不同，但是两者的形成过程中都涉及到细胞外表的粘附分子和与肿瘤浸润转移存在亲密关系的蛋白酶类。国外的文献报道证实：能形成血管生成拟态的恶性黑色素瘤细胞的细胞粘附分子血管-内皮细胞钙粘附蛋白、基质金属蛋白酶类P2、T1-P表达程度在形成血管生成拟态的区域内升高。我们的实验就是通过免疫组化检测血管生成拟态周围和内皮依赖性血管周围肿瘤细胞外表粘附分子D31和蛋白酶类P2、P9、组织蛋白酶D等的表达，研究内皮依赖性血管和血管生成拟态在肿瘤发生开展过程中的变化，同时进一步深化研究和完善血管生成

19、拟态的分子机制。肿瘤细胞在形成血管生成拟态的过程中，肿瘤细胞与细胞外基质互相作用，获取细胞外微环境中信息，并使细胞外蛋白水解、重塑，排列形成可以运送血液的管道样构造，因此多种细胞外基质中与肿瘤浸润和转移有关的蛋白酶必然参与其中。Ps是一族至少包括19类的锌依赖性内肽酶，它们的共同作用是可降解所有的细胞外基质成分。Ps主要以酶原形式分泌到细胞外，一般情况下它们与组织金属蛋白酶抑制剂TIPs以11比例结合形成复合物。体内的Ps具有基因转录程度、翻译后程度调节。P2和P9分子量分别为72Kda和92KDa，是两种重要的蛋白酶，与肿瘤浸润和转移亲密相关。因此我们对黑色素瘤细胞进展P2和P9免疫组化染色

20、，P2阳性率为74/11470%，P9阳性率为67/11458%，与国外实验结果类似。同时我们的实验结果证实P2和P9在血管生成拟态生成的早期第4、5天出现高表达，国外学者的研究发如今黑色素瘤形成的初期P9的表达会发生变化，提示P9表达与早期黑色素瘤的浸润有关，也有报道称P9出如今进展期黑色素瘤中，而不是在早期。研究发现拟态周围肿瘤细胞P2的表达高于远离拟态肿瘤细胞的表达，内皮依赖血管周围的肿瘤细胞P2的表达与远离内皮依赖血管的表达之间无明显差异，血管生成拟态与内皮依赖血管周围肿瘤细胞P2的表达之间无明显差异；对血管生成拟态密度与P2的表达做相关分析，发现两者之间存在亲密相关，由此我们认为P2

21、对恶性黑色素瘤细胞形成血管生成拟态起着重要作用，尤其对早期血管生成拟态的形成。统计学分析不支持P2与内皮依赖性血管之间存在相关，但文献报道P2是参与内皮依赖性血管形成的重要分子。RihardEB等研究如今体外培养的黑色素瘤细胞形成血管生成拟态区域P2、T1P、层粘连蛋白及其水解片段r2高表达，添加P的抑制剂可降低层粘连蛋白及其水解片段的程度，同时也有效阻断了黑色素瘤细胞形成血管生成拟态的这种才能1315。最近的研究进一步证实层粘连蛋白及其水解片段可以与细胞外表的整合素受体结合，对细胞的增殖和迁移具有重要作用。这提示我们黑色素瘤的血管生成拟态的形成不仅需要蛋白酶降解细胞外基质，同时细胞外基质的降

22、解产物在该过程中的作用同样不可缺少。当将人的脐静脉内皮细胞培养于基底膜样物质上时，内皮细胞很快排列成直线，围成管状，编织成血管网，用明胶酶谱分析显示培养液上清液中含有大量活化的P2和P9；人工添加两种酶的抗体可降低甚至完全阻遏基质中内皮细胞管状构造的形成；P2的活性显然是软骨肉瘤形成模型中向血管生成表型转化所必须的。血管生成拟态周围肿瘤细胞P9表达较高，远离血管生成拟态的肿瘤细胞低表达，内皮依赖性血管周围肿瘤细胞高表达，远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞P9的表达较低。统计学分析显示血管生成拟态周围的肿瘤细胞P9的表达高于内皮依赖性血管周围的肿瘤细胞的表达，血管生成拟态周围的肿瘤细胞的表达与远离血管

23、生成拟态的肿瘤细胞的表达之间无差异，内皮依赖性血管周围的肿瘤细胞的表达与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞表达之间无差异，说明血管生成拟态周围肿瘤细胞的P9的表达对血管生成拟态的形成有所奉献，统计学结果不支持我们的结论，目前尚无文献报道P9参与血管生成拟态的形成，因此需要今后进一步讨论两者的关系。我们的实验结果显示P9在内皮依赖性血管周围的表达在血管生成拟态形成的第5天出现高表达，说明P9在内皮依赖性血管的形成中发挥作用，统计学分析不支持P9的表达与内皮依赖性血管的相关，而现有的文献均支持P9对内皮依赖性血管的奉献。有人在研究鼻咽癌时发现癌细胞在分化过程中，它可诱导周围间质的成纤维细胞、浸润的单核细

24、胞同时表达P9，特别是巨噬细胞产生大量的P9，在肿瘤微环境内可有效地影响肿瘤细胞的血管化、生长速度、基质的形成及基质的降解。Deniser等在胰腺癌的转基因鼠模型中发现P9是血管形成开关机制的扳机点16，17。Nastris等认为由于基质分子的降解，使得原来被隔离在细胞外基质内的生长因子VEGF、BFGF、IGF1得以释放和激活肿瘤通过产生大量的P2、P9而加速新生血管生成18、19。内皮细胞在根底状态下表达一定程度的Ps，在受到刺激或处于某种特定状态下其表达谱或表达量有所改变，体外培养的内皮细胞一旦形成卵石样单层，即表达合成P1、P2、P3、P9和TP，一般情况下有两种以上的Ps共同表达，作

25、用为相加或互相激活；不同组织的内皮细胞对各种刺激的反响不同，说明在体内Ps的程度受到准确调节，以维持细胞和组织的完好性。以上的研究都支持P2和P9参与了内皮依赖性血管的形成，并在其中发挥主要作用，而我们的实验未得出同样结论，可能与我们的样本量小，实验周期偏短有一定关系。组织蛋白酶DathepsinDD是一种相对分子量为3.4104的天门冬氨酸肽链内切酶，广泛存在于不同的组织细胞和肿瘤细胞中，在酸性环境下降解细胞外蛋白质，有利于肿瘤细胞的浸润和转移，与乳腺癌、膀胱癌等的浸润和转移亲密相关，目前有关它在血管生成拟态中作用的研究未见报道。我们对恶性黑色素移植瘤进展D免疫组化染色，阳性结果参照Dykins的标准，肿瘤细胞的胞浆和胞膜表达均为阳性，阳性表达率77/11467%，与国外文献报道根本一致；血管生成拟态周围的肿瘤细胞表达高于远离拟态的肿瘤细胞，内皮依赖性血管周围肿瘤细胞的表达与远离内皮依赖性血管的肿瘤细胞的表达之间无明显差异，血管生成拟态周围肿瘤细胞的表达与内皮依赖性血管周围肿瘤细胞表达之间无明显差异，统计分析结果显示血管生成拟态周围的肿瘤细胞的表达高于血管周围的肿瘤细胞的表达，血管生成拟态周围与远离血管生成拟态