蛋白质免疫印迹技术详解

1、蛋白质免疫印迹技术详解1第1页一、Western Blot 介绍二、Western Blot 普通流程三、Western Blot 成像系统四、Western Blot 常见问题分析主要内容2第2页一、Western Blot 基本原理3第3页一、Western Blot 优点高分辨率电泳技术特异敏感抗原-抗体反应1-5ng中等大小靶蛋白4第4页一、Western Blot 应用目标蛋白表示特征分析目标蛋白与其它蛋白、RNA互作 5第5页蛋白样品制备SDS电泳转膜（PVDF或NC膜） 封闭一抗 洗涤酶标二抗反应洗涤显影 二、Western Blot普通流程6第6页LB： 62.5 mmol/L

2、 Tris-HCl （pH6.8 at 25）, 2%SDS ，10%Glycerol(甘油) ，50 mmol/L DTT(二硫苏糖醇) ；溴酚蓝在裂解液中加入适当蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解，从而确保检测准确性！蛋白样品制备7第7页8SDS是一个很强阴离子表面活性剂，它能够断开分子内和分子间氢键,破坏蛋白质分子二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）能够断开二硫键，破坏蛋白质四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后侧链与SDS充分结合形成带负电荷蛋白质-SDS 胶束。蛋白质电泳迁移率主要决定于亚基相对分子质量，而与其形状及所带电荷性质无关。蛋白样品制备第8页蛋

3、白质-SDS胶束特点：（1）含有相同形状，形状像一个长椭圆棒;（2）平均1g蛋白质结合 1.4gSDS;（3）短轴对不一样蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同;（4）长轴长度则与亚基分子量大小成正比;9第9页Bradford法：考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不一样颜色形式，在一定浓度乙醇和酸性条件下，可配成淡红色溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白浓度高低成正比 。双缩脲法：Cu2+与蛋白质肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波优点有最大吸收Lowly法：第一步就是双缩脲反应，即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物

4、，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。蛋白样品定量10第10页不连续电泳缓冲体系。SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状影响，而只取决于蛋白质分子量大小。11聚丙烯酰胺凝胶电泳第11页不连续电泳系统作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl 低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，依据蛋白大小电泳缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸系统12第12页聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺

5、加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵三维网状结构凝胶，该凝胶化学惰性强，含有一定机械强度和透明度，是良好电泳介质，以此凝胶为支持物电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳13第13页凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431020-807.536-945.057-21214第14页15第15页灌制分离胶隔绝空气ddH2O乙醇16第16页灌制浓缩胶插入梳子17第17页Staking gelSeparating gel上样18第18页电泳

6、19第19页转膜半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置缓冲液中，电转4h或过夜。20第20页膜选择PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中惯用一个固相支持物。PVDF膜是疏水性，膜孔径有大有小，伴随膜孔径不停减小，膜对低分子量蛋白结合就越牢靠。大于20KD蛋白选取0.45um膜，小于20KD蛋白选取0.2um膜。预处理，用甲醇处理目标是活化膜上正电基团，使其更轻易与带负电蛋白结合。21第21页湿转系统22第22页转膜23蛋白x(kDa)转膜液转膜条件x20甘氨酸（0

7、.2M），3.0gTris碱（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），用水定容至。250mA恒流转3 hrs20 x120配方同上250mA恒流4 hrs120 x200甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），0.05%SDS，用水定容至。250mA恒流转6 hrs200 x配方同上500mA恒流转4 hrs不一样大小蛋白转膜条件：23第23页半干转移系统24第24页封闭为防止作为检测试剂特异性第一抗体与膜发生非特异性结合而使非特异性背景提升,需对膜上潜在结合位点进行封闭处理。脱脂奶粉（5）、BSA（1）25第25页一抗、二抗孵育加入

8、一抗溶液与滤膜温育，372小时或4 过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次5min。加入用TBST配制二抗，摇床上迟缓摇动， 室温孵育1-2小时。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次5min，最终一次用TBS。26第26页二抗与底物反应显色化学发光显色法(HRP)ECL中luminol被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强影响发光原因主要有： 1.含HRP抗体； 2.发光试剂； 3.反应杂质;27第27页洗脱抗体一抗洗脱二抗洗脱一抗种属起源不一样时，strip二抗即可28第28页三、显色暗室曝光Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统29第29页

9、Tanon 5200性能特点适合用于高分辨率和高灵敏度图像拍摄；可设定连续采样次数、起始及终止曝光时间，进行动态连续拍摄，拍摄得高质量图片；30第30页Tanon 5200软件特点31含有序列图像保留功效，无需单张图片分别存放；含有分析软件，可进行泳道密度扫描、半定量计算，分子量计算；图像叠加分析功效：可对两个图像进行合并显示，并进行分析；第31页胶不平？凝胶漏液？ 胶板洗刷洁净 加入AP和TEMED量要适当加入试剂后摇匀，使其充分混合，预防部分胶块聚合不均匀温度适当，受热不均匀造成胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐四、SDS常见问题对 策32第32页条带比正常窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽可能混合均匀，动作轻缓拔梳子要快速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其它条带造成宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否适当对 策四、SDS常见问题33第33页凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长久使用造成海绵变薄，“三明治”结构不紧凑造成。确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温对 策四、SDS常见问题34第34页1.膜没有均匀浸湿2.