银杏叶提取物对局灶性脑缺血大鼠脑组织炎症信号TLR4表达的影响

1、银杏叶提取物对局灶性脑缺血大鼠脑组织炎症信号TLR4表达的影响【关键词】银杏叶提取物;脑梗死;大鼠;Tll样受体4脑血管病是临床常见并多发病之一，尤其脑梗死(I)具有较高的发生率、致残率、病死率，I后缺血损伤的机制复杂，其中过度的炎症免疫反响存在于I后坏死及缺血区域，导致炎性损伤，此已成共识，因此减轻炎症损伤成为治疗急性脑梗死(AI)的主要途径之一，研究证实TLR4与非生物性炎性损伤关系亲密1，2。银杏叶味甘、苦、涩，性平，有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛成效，其主要有效成分银杏叶提取物(GBE)已被广泛应用于脑血管疾膊3、认知功能障碍4、炎症5等相关疾病的治疗，但其对I的研究鲜有报道。本实验观察

2、银杏叶提取物对I大鼠脑组织TLR4基因及蛋白表达的影响，讨论银杏叶提取物抗I的可能作用。1材料与方法1.2实验方法将60只大鼠随机分为：假手术组，模型组和银杏叶提取物组。每组又分为6、12、24和48h，4个亚组，每亚组均为5只大鼠。假手术组大鼠不插线，模型组及银杏叶提取物组线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞的动物模型。各组均为腹腔给药，将药物以蒸馏水制成一样浓度混悬液(40g/l)，模型组及假手术组均给予1l生理盐水，于手术完毕后3h给药1次，之后每天1次，直至相应时间点处死动物，取前囟前2至前囟后3脑组织，以进针点为界分为前后两局部，前局部取梗死灶周围脑组织，快速称取100g，置于冰浴中的匀

3、浆器并迅速匀浆，用于抽提总RNA。后局部脑组织用4%多聚甲醛固定液固定，4下持续固定2448h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，在切片机上连续冠状切片，片厚5，-20保存。1.3.1梗死灶周围脑组织总RNA抽提与纯化在冰浴匀浆器中参加1lTrizl及100g组织，迅速研磨，将匀浆液装于EP管中，参加200l氯仿剧烈震摇30s，间隔放冰盒保温，反复震荡，4，12000r/in，低温离心20in，取上层水相转移至另一EP管中，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20过夜，4，12000r/in，低温离心20in，弃上清，加75%乙醇700l轻轻混匀，4，12000r/in，低温离心10in，轻轻吸出上清，

4、室温垂直放置2030in凉干，参加DEP水20l溶解，留取1l待测RNA浓度。1.3.2逆转录(RT合成第1条链DNA)在PR管中建立如下反响体系：依次参加如下试剂：5RT缓冲液5l、dNTP(10l/L)2.5l、Rnasin1l、Prier1l、2LV1l，RNA及DEP水总共14.5l。短暂离心振荡混匀4低温短暂离心;在PR仪中，37反转录50in，955in灭活反转录酶，立即冰浴，-20保存。1.5免疫组化染色免疫组化染色采用SAB法，石蜡切片经常规脱蜡，梯度酒精浸泡后充分水洗，置于3%H22/甲醛溶液中15in，以消除内源性过氧化物酶活性，浸入0.01l/L、pH6.0枸橼酸盐缓液中

5、，加热至9298热修复抗原，20in后冷却至室温，0.01lPBS(pH6.0)振洗5in3次，正常山羊血清封闭液孵育30in。滴加兔抗鼠TLR4多克隆抗体(1400)，4孵育过夜。0.01lPBS(pH6.0)振洗5in3次，滴加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，37孵育45in。吸去二抗，0.01lPBS(pH6.0)振洗5in3次;参加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37孵育30in。0.01lPBS(pH6.0)振洗5in3次，DAB显色，适时终止反响;苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。阴性对照以PBS代替一抗。1.6统计学处理数据均以xs表示，组间比拟运用单因素方

6、差分析，两两比拟运用q检验，所有数据用SAS软件处理。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1各组脑组织TLR4RNA相对表达各组各时间点TLR4RNA均表达，与假手术组相比模型组各时间点TLR4RNA相对表达均明显升高，且在24h达顶峰，持续到48h差异有统计学意义(P0.01);银杏叶提取物组TLR4RNA相对表达明显低于模型组(P0.01)，见表1，图1。表1各组大鼠脑组织TLR4RNA相对表达程度的比拟1)与模型组比拟，2)与6，12h组比拟：均P0.01，下表同图1各组大鼠脑组织TLR4RNA表达2.2各组大鼠脑组织TLR4蛋白的表达假手术组各时间点偶有TLR4少量表达;TLR4表达以小胶质细胞为主，位于细胞胞浆内。模型组在观察的时间段内6、12、24及48hTLR4蛋白表达明显增多，于缺血后24h达顶峰，持续大约48h。银杏叶提取物组TLR4蛋白相对表达明显低于模型组(P0.01)，见表2。表2各组大鼠脑组织TLR4蛋白的表达3讨论银杏叶提取物抗炎、抗氧化及免疫调节作用正逐渐受到重视。脑缺血损伤见于许多临床病理过程，影响这一过程的因素是多方面的。一般认为，脑缺血损伤是典型的非感染性炎症损伤，