试验方法总结：动物模型部分

1、实验方法总结：动物模型部分 TOC o 1-5 h z 1、研究肿瘤细胞增殖 12、研究肿瘤细胞转移 2体外（浸润模型） 2体内（转移模型） 23、研究肿瘤细胞耐药 4耐药细胞株的建立 4裸鼠移植瘤耐药模型的建立 5从月中瘤起源分，月中瘤动物模型的分类如下:从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析：1、研究月中瘤细胞增殖细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照 组、阴性对照组、实验组。取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行月中瘤细胞注射XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮

2、下接种。每只接种 2 x 106个细胞，注射体积为100山。此后，每隔5天测量注射部位月中瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠 颈椎脱臼处死，取出月中瘤称重，将月中瘤置蓝色背景布上拍照，月中瘤一分为二，一 份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80C冻存。2、研究月中瘤细胞转移月中瘤转移的模型包括两大类：体外（浸润模型）和体内（转移模型）。体外（浸润模 型）：了解月中瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究月中瘤细胞的转 移性即月中瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。体外（浸润模型）例：浸润型脑胶质瘤动

3、物模型的建立方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白 的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔（坐标是冠状缝后0.5 cm ,矢状缝右侧2.5 cm）。取2 山胶质瘤干细胞以1 x 104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内（深度是2.53 mm）。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光（立 体荧光显微镜下）病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以 及干细胞标志物等。体内（转移模型） 例：肩胛部皮下接种的方法建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型， 目的：观察壮骨镇痛胶 囊对裸鼠乳腺

4、癌移植瘤模型 骨转移相关指标整联蛋白a V03 （ITG-aV03）及骨唾 液酸蛋白（BSP）表达的影响。方法：取处于对数生长期的 乳腺癌细胞MDA-MB-231 ,用0.25%胰蛋白酶消化 制成单细胞悬液，收集细胞，细胞计数板法计数，调节细胞浓度为2Xl07j/mL, 按0.2 mL/只接种于裸鼠右前肢肩胛上区，接种部位可以见一皮丘，质软， 2天 后，皮丘基本吸收，10天后接种部位可触及米粒大结节，质硬，即乳腺癌移植 瘤组织。检测壮骨镇痛胶囊 对移植瘤组织中IGT-av阳和BSP表达的影响。例：原位移植建立人 肾透明细胞腺癌 裸鼠转移模型，观察月中瘤病理学特征。方法：收集体外培养的对数生长期

5、 786-0细胞（人肾透明细胞腺癌细胞），进行 裸鼠皮下注射，待皮下移植瘤长至直径为 1.5cm左右时取出，以相同方法进行 鼠间传代（每代2只），34代后取出移植瘤，剪成1mm 3大小进行肾包膜下 原位接种，获人月中瘤裸鼠转移模型，即外科原位移植（ Surgical Orthotopic Implantation , SOI）模型，裸鼠垂死时脱颈处死，取出肺脏转移灶体外培养， 胰酶消化传代45次后即获得较纯的月中瘤细胞，命名为 786-0-LM1。同时采用 786-0细胞悬液进行肾包膜下原位注射，建立细胞原位注射模型。肿癌的常见转移部位膀胱癌淋巴结.肾、泌尿生si系统、腹膜脑肿瘤脑膜乳腺俎骨.

6、肺.肝.淋巴结.脑.骨髓皂颈瘪骨.肺.肝.淋巴结.肾、泌尿生殖系统结肠癌肺.肝,淋巴结.肾*泌尿生殖系统食管疡淋巴结.骨 肺.肝.肾上膘头颈部肿痛肺.皮肤、淋巴结肝痛骨.肺、淋巴结肾癌骨.肺.肝.淋巴结.随白血病/淋巴痛 骨、骨髓，皮肤.肺，淋巴结.脑肺眼胃.骨髓.肝.淋巴结.脑.肾.泌尿生殖系统黑色素瘤骨.肺.肝,淋巴结、骨髓.皮肤、脑卵巢癌肺.肝.淋巴结.肠、旗膜胰腺癌肺,肝.肠、淋巴结前列腺癌骨.骨髓、肺、肝.淋巴结肉痛肺.肝.淋巴结胃癌骨.肺.肝.淋巴结塞丸瘪骨.肺.肝.淋巴结甲状腺癌骨.肺.淋巴结子宫癌骨3、研究月中瘤细胞耐药耐药细胞株的建立本实验以紫杉醇为诱导药，以人食管鳞癌细胞系

7、EC109为诱导对象，采用高剂量间歇诱导结合时间递增的方法建立耐药细胞株。终浓度为0.625 回/ml的紫 杉醇（此浓度是紫杉醇对EC109细胞IC50的12.5倍）作用于对数生长期的EC109两个小时，之后弃含药培养基，用 4 CPBS洗三次，0.25%胰蛋白酶消化处理，800r/min离心4min收集细胞，加培养基重悬，重新接种于培养瓶继续培养；24小时后可见大量细胞死亡，不断去除凋亡细胞，扩增活细胞，至生 长状态良好，达到70%80%饱和时，传代培养3代；重复上述操作两次，即EC109细胞在此阶段共被药物作用 3次，得到细胞 EC109/Taxol。MTT实验 测定亲本细胞与耐药细胞对多种细胞毒类化合物的敏感性。裸鼠移植瘤耐药模型的建立无菌条件下收集亲本株 EC109和 耐药株EC109/Taxol细胞，用无菌生