二代测序文库构建

1、二代测序（WGS&WES）文库构建流程介绍韩丽萍.4.121/25目录01 基本概念介绍04 疑问与讨论02 基础文库构建WGS文库&WES预文库03 杂交捕捉技术WES文库2/2501基本概念介绍3/25基本概念介绍全基因组重测序（ Whole-Genome sequencing, WGS ）是对已知基因组序列物种进行不一样个体基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。外显子组测序（ Whole-exome sequencing, WES ）是利用设计好探针将坐标已知全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后，进行高通量测序基因组分析方法。对于人类基因组来说，外显子区域大约占到基因组1%

2、，大约在30M左右。普通WES测序深度为50X200X，详细深度依研究目标而定，其中个体之间变异程度较WGS小。4/25Reads in IGVIntegrative Genomics Viewer(IGV) 是一款针对高通量测序数据进行可视化专业软件。它支持各种数据类型，包含基于芯片测序、二代测序和基因组注释数据等。能够帮助用户对分析结果中相关文件在可视化条件下进行浏览分析。5/2502基础文库构建6/25文库分子模型随机打断DNA末端修复3端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检7/25随机打断WGS:300-400bpWES:150-250bp随机打断DNA末端修复3端加A（dATP）

3、加接头PCR扩增文库质检8/25随机打断DNA末端修复3端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检末端修复5末端磷酸化5533PP聚合补平55335533外切削平553355339/25随机打断DNA末端修复3端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检5533PP5533AAPP加A10/25随机打断DNA末端修复3端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检Indexed AdaptorGeneral Adaptor11/25随机打断DNA末端修复3端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检扩增扩增P5、P7引物P5端通用引物（一个）P7端含有index引物（各种）经过加接头引入index经过

4、PCR扩增引入index12/25随机打断DNA末端修复3端加A（dATP）加接头PCR扩增文库质检末端修复3端加A（dATP）加接头PCR扩增On PCR13/25磁珠纯化与片段分选片段分选第二步去掉小片段片段分选第一步去掉大片段14/2503杂交捕捉技术15/25液相杂交捕捉技术介绍利用寡核苷酸序列合成技术，合成大量生物素标识RNA/DNA“诱饵”，利用碱基配对原理，经过生物素与链霉亲和素结合将目标区域进行富集技术。惯用液相杂交捕捉试剂主要有Agilent、Roche和illumina，国内主要是艾吉泰康。16/25 封闭与杂交：（预文库/Blocking oligos） + 杂交捕捉液/

5、生物素标识探针/RNAase抑制剂 。95度变性解链，65度退火复性，杂交16-24h。生物素标识探针（RNA, 120nt）Cot-1 blocker接头 blocker外显子Cot-1重复序列接头 封闭与杂交捕获和洗脱PCR扩增富集文库质检17/25 捕捉与洗脱1、磁珠上链霉亲和素与探针上生物素结合（常温反应30min）。封闭与杂交捕获和洗脱PCR扩增富集文库质检18/25Complex 捕捉与洗脱2、含有Complex离心管放置到磁力架上等液体澄清以后，将上清去除即可去除多出或未利用“Blocking oligos、生物素标识探针”以及“杂交捕捉液”。3、 65度条件下进行洗脱，去除非特异性片段。19/25封闭与杂交捕获和洗脱PCR扩增富集文库质检20/25杂交、捕捉与扩增-121/25杂交、捕捉与扩增-222/25杂交、捕捉与扩增-