基因工程 基因文库的构建

1、基因工程 基因文库的构建第1页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Gene library (Genomic library) ：A collection of independent clones representing the entire genome of an organism.First step to isolate a target DNA sequence from an organisms genome. 第2页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二1976 L. Clark, J. Carbon n=ln(1-p)/ln(1-f)n

2、: numbers of recombinant required in full libraryp: probability of target gene in libraryf: rate of average insertion DNA sizes to genome第3页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Mammal 3109bpIf p=99% cloned fragment 20kb f=20kb/3109 n=690773.2E. coli 4639221bp p=99% f = 20kb/4600kb n=1056.9 p=99% f =10kb/4600

3、kb n=2116 第4页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二cDNA library:A collection of independent clones representing the entire cDNA reversely transcripted from mRNA in a specific tissue of an organism in a specific phage.第5页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Bacterial colonies consisting of genomic DNA library第6页，共38页，2

4、022年，5月20日，22点20分，星期二Choosing vectorSteps of library constructionPlasmid 10kb Phage 0-23kbCosmid 45kbBAC 100kb（250-300kb?）YAC 300kb-1.2Mb第7页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二SUP4 基因：酵母细胞Trp-tRNA 基因的赭色突变抑制基因，含有克隆位点。在发生Ade2-赭色突变的宿主细胞中，如果没有外源基因的插入，则突变基因表达受抑制受体菌为Ade+，形成白色菌落；当有外源基因插入时，SUP4表达将被阻断，抑制作用被消除，受体菌为Ad

5、e-，菌落为红色。第8页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二第9页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Cosmid Half of phage. If 700000, cosmid 350000 (菌落数)Cosmid is usually applied in large size DNA cloning, but it is much more difficult than phage，because there is no much experience.（pJB8 and c2RB are more used in gene library co

6、nstruction)第10页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二 phage vector1970s, like Charon 4A and g t-WES，1520kbPresently, EMBL lines, like 2001，DASH， Charon 38-40，GEM-11 etc. (replacement vectors), 20-24kb第11页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Basic principles in choosing vectorEasily recover foreign DNA from ; Easily pr

7、epare 2 arms;Availability of vector sequence, RE mapping;Amber mutation (琥珀突变) in vector arms as special screening model;Active gam gene in recombinants；Chi sequence in vector arms.Gam蛋白与核酸外切酶(Exonuclease V) 结合，抑制了宿主的RecBCD 的核酸外切酶V活性，使得外来DNA分子不会被切割降解。第12页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Enter lytic cycle

8、 replication give rise to 50 genome, then rolling cycle replicating to produce concatemer, and finally it is cut and packaged into particles.recB/recC/recD products, controlling recombination, and have activities of Exnulease V, inhibiting DNA replication transfer to rolling cycle.gam gene products

9、bind and inactivate exnuclease V. 第13页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二If gam-, recA product is required to package , but form small plaques (小噬斑), so the host must be recA+.But recA+ may cause other recombination, thus we use vector recA-/gam+, to realize proliferation in recA- host.第14页，共38页，2022年，5月20

10、日，22点20分，星期二Charon 32-35, 40chi site：8bp, in natural E. Coli, 1 copy of every 5-10Kb, but dont exist in wild DNA, not required for recombination.red- gam-，foreign insertion DNA with chi site would form clear plaques. If not, form small plaques. Because of uncertainty of chi site in foreign DNA, the

11、recombinants form large and small plaques（adding chi site in vector, such as 2001, DASH, F1X,EMBL lines）第15页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二野生型以及red- gam- 噬菌体之蚀菌斑表型噬菌体寄 主 菌Rec+recA-recA-recBC-P2 溶源细菌 red-gam- red-gam- +非常小小+-+微小小-第16页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Library construction by phageTotal DNA ext

12、ractionInitial length of DNA 4 time of cloned DNA; otherwise too few efficient fragments. Preparation of vector arms buying preparation and purification (gradient centrifugation with sucrose or NaCl) RE digestion BamHI / EMBL XhoI / GEM-11第17页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Digestion of genome DNA gener

13、ally by Sau3AI recover 20-24kb （ agarose or gradient centrifugation) RE digestion produce sticky ends, but with great random, so the number of library should be larger than the theoretic value. Physical methods, splicing DNA by sonication.Ligation and packaging Long concatemer ，packaging particles（s

14、tore in 4 for 6 months）. Particles 100-1000 times of naked DNA in transfection rate.第18页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二 Dephosphoration of vector increase ligation and packaging efficiency Double RE digestion of vectorEMBL lines，2001，XDASH，Charson 40,35,34）EMBL 3A: SalI BamHI EcoRI E1 B1-S1 In ligation

15、 reaction phage 108pfu/g DNADigestion by BamHI and EcoRI and removement of small fragment, decrease the number of recombinants to one hundredth.Combination with other methods (such as Spi screening) one thousandth to one hundredth 第19页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Partial fulfillment of 3 recessed end

16、 if genome DNA-GATC-CTAG- GATC-CTAG -Sau3AI-GA GATC-CTAG AG-KlenowdATP /dGTP-CTCGAG-GAGCTC-XhoIKlenowdCTP /dTTP-CTC TCGAG-GAGCT CTC-互补GEM-11Genome DNAVector 第20页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Lysis plaques of lambda phage on E. coli bacteria 第21页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Plaque number in different pl

17、ate dishes第22页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Amplification and store E. coliForm plaquesIdentification of recombinant with foreign DNACharacterization of recombinants with DNA第23页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Characterization of recombinants in situ blot of plaques (噬斑原位杂交)第24页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期

18、二 Blot screening with probe Purification Analyzing Southern blot, RE cut, sequencing, immunological method第25页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Construction of sub genomic libraryA type of library containing special part of genome DNA. e.g. plasmid DNA, mitochondria DNA, special RE DNA fragment.第26页，共38页，

19、2022年，5月20日，22点20分，星期二Example: cut genomic DNA by different REs, Southern blot found target gene in 8.3kb SpeI fragment.recover this fragment for subgenomic library construction第27页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Isolating mRNAConstruction of cDNA library第28页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Integrity of mRNA

20、 large molecular weight protein cell-free translation system target peptide immunoprecipitation (免疫沉淀) and SDS mRNA sizes （500bp8kb， mainly 1.52kb） removing small fragment第29页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Synthesizing first strand of cDNA the produced cDNA should correspond to the above range. 第30页，共3

21、8页，2022年，5月20日，22点20分，星期二mRNA abundance high-abundance mRNA 珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白. 50-90% low (rare) 0.5%Causing large library, and difficulties to characterization of target gene第31页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二Enrichment of mRNAisolation of mRNA by molecular sizes firstly denature, then gradient centrifug

22、ation (sucrose） in vitro translation to detect its activityIsolation of cDNA by molecular sizes recently applied, especially for large mRNA第32页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二 Immunological purification of polyribosomeAntibody against target peptide In immunoaffinity purification (protein A-Sepharose) column, monoclone antibody make polyribosome bind protein A-spharose column, EDTA wash, and oligo (dT) enrich mRNA. Only 0.01-0.05% of total mRNA by this method第33页，共38页，2022年，5月20日，22点20分，星期二AMV (禽白血病病毒) (42) M