Lowry法检测蛋白质含量

1、Lowry法检测蛋白质的含量蛋白含量检测的方法11凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。蛋白质是含氮的有 机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫 酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准 溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。由于蛋白质含 氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。1.2双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜 试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中 含有肽键时（多肽），试液中的铜与

2、多肽配位，配合物呈紫色。紫色络合物颜色 的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比 色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/m 1。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。 主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。1.2.1双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2，是两个分子脲经180C左右加热，放出一个分 子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称 为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳 原子相连

3、的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。1.3紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋 白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值） 与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正 比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进 行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度 的盐，例如生化制备中常用的（NH4） 2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。此 法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋 白质含量时，对那些与标准

4、蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。1.4考马斯亮蓝法考马斯亮蓝G-250 (Coomassie brilliant blue G-250 )测定蛋白质含量属于染 料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结 合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值 与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室 温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便 快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowr

5、y法还高4 倍, Bradford法测定蛋白浓度不 受绝大部分样品中的化学物质的影响，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓 度范围为01 000yg/mL，最小可测2.5yg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白 质快速测定方法。考马斯亮蓝G250染料试剂由考马斯亮蓝G250、乙醇、磷酸组成。用于考 马斯染料结合(Bradford)分析的总蛋白测量。其特点在于对蛋白样品中可能存在 的大多数盐、溶剂、缓冲液、硫醇、金属螯合剂、还原性物质等均不排斥。Coomassie G-250PROTEINQCHjCHjBLUEProtein Coomassie G-250PROTEINQCHjCHjBLUEPro

6、tein - DyeCo m：plexAcid1.5 Folin酚(Lowry)法(增加试剂图片)Lowry法系根据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋 白质-铜复合物，此复合物中的酪氨酸和苯丙氨酸残基使酚试剂的磷钼酸盐-磷钨 酸盐还原，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质 含量成正比，根据蛋白样品的吸光度，计算蛋白样品的蛋白质含量。Lowry法可 检测的最低蛋白质含量达5mg，通常测定范围是20250mg。151蛋白质蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生 命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组

7、成单位。 它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细 胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%20%，即一 个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.612kg。人体内蛋白质的种类很多，性 质、功能各异，但都是由20多种氨基酸(Amino acid)按不同比例组合而成的, 并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多 肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。蛋白质中一定含有碳、氢、氧、氮元素。蛋白质是由a氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以 上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。蛋白质就是

8、构成人体组织 器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质 就没有生命活动的存在。1.5.2蛋白质结构蛋白质是以氨基酸为基本单位构成的生物高分子。蛋白质分子上氨基酸的序 列和由此形成的立体结构构成了蛋白质结构的多样性。蛋白质具有一级、二级、 三级、四级结构，蛋白质分子的结构决定了它的功能。一级结构(primary structure)：氨基酸残基在蛋白质肽链中的排列顺序称为 蛋白质的一级结构，每种蛋白质都有唯一而确切的氨基酸序列。二级结构(secondary structure)：蛋白质分子中肽链并非直链状，而是按一 定的规律卷曲(如a-螺旋结构)或折叠(如卩-折叠结

9、构)形成特定的空间结构, 这是蛋白质的二级结构。蛋白质的二级结构主要依靠肽链中氨基酸残基亚氨基(NH)上的氢原子和羰基上的氧原子之间形成的氢键而实现的。三级结构(tertiary structure)：在二级结构的基础上，肽链还按照一定的空 间结构进一步形成更复杂的三级结构。肌红蛋白，血红蛋白等正是通过这种结构 使其表面的空穴恰好容纳一个血红素分子。四级结构(quaternary structure)：具有三级结构的多肽链按一定空间排列方 式结合在一起形成的聚集体结构称为蛋白质的四级结构。如血红蛋白由4个具有 三级结构的多肽链构成，其中两个是a-链，另两个是卩-链，其四级结构近似椭 球形状。1

10、.5.3蛋白质连接方法用约20种氨基酸作原料，在细胞质中的核糖体上，将氨基酸分子互相连接 成肽链。一个氨基酸分子的氨基和另一个氨基酸分子的羧基，脱去一分子水而连 接起来，这种结合方式叫做脱水缩合。通过缩合反应，在羧基和氨基之间形成的 连接两个氨基酸分子的那个键叫做肽键。由肽键连接形成的化合物称为肽。1.5.4氨基酸含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组 成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物。氨基连在a-碳上的为a-氨基酸。组成蛋白质的氨基酸均为a-氨基 酸。20种氨基酸缩写中文名称英文名称三字母缩写单字母符号甘氨酸Glyc

11、ineGlyG丙氨酸AlanineAlaA缠氨酸VaiineVaiV亮氨酸LeucineLeuL异亮氨酸IsoleucinelieI脯氨酸ProLineProP苯丙氨酸Pheny_a_aninePheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸TryptophanTrpW丝氨酸SerineSerS苏氨酸ThreonineThrT半胱氨酸CystineCysC蛋氨酸MethionineMetM天冬酰胺AsparagineAsnN谷氨酰胺GLutarnineGinQ天冬氨酸Aspart icac idAspD谷氨酸GlutamicacidGluE赖氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR组

12、氨酸HistidineHisH1.5.5吸光光度法吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色 法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱法。吸光光度法是采用分光器获得纯度较 高的单色光，基于物质对单色光的选择性吸收测定物质组分的分析方法。吸光光 度法是借助分光光度计测定溶液的吸光度，根据朗伯一比耳定律确定物质溶液的 浓度。吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况。OD值OD值(optical density)表示某一物质在某一个特定波长下的吸光度；ABS是 吸光值absorbance的缩写。在分析化学里，某一化学物质都可吸收一定波长的 光，并且对光的吸收度与此化学物质的浓

13、度成正比。因此可以利用吸光度的大小 来测定某种物质的浓度。其中某物质在特定波长下对光的吸收度，就是OD值， 一般用经过石英管后的光强比上照射到石英管前的光强来表示。吸光度值（abs/AU）定义吸光度，absorbance，是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光 线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关，只要光的波长被固定下 来，同一种物质，吸光系数就不变。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度 减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用A表示。A=abc，其中a为吸光系

14、数，单位L/（gcm）,b为液层厚度（通常为比色皿的 厚度），单位cm，c为溶液浓度，单位g/L影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过 影响c,而影响A。符号A,表示物质对光的吸收程度。97801式中10是通过均匀的液体介质 的一束平行光的入射光的强度；It是透射光强度；T是透射比。A值越大，表示 物质对光的吸收越大。根据比尔定律，吸光度与吸光物质的量浓度c成正比，以 A对c作图，可得到光度分析的校准曲线。在多组分体系中，如果各组分的吸光 质点彼此不发生作用，那么吸光度便等于各组分吸光度之和，这一规律称吸光度 的加和性。据此可以进行多组分同时测定及某些化学反应平衡常

15、数的测定。在吸 光度测定中，为抵消吸收池对入射光的吸收、反射以及溶剂、试剂等对入射光的 吸收、散射等因素，可选用双光束分光光度计，并选光学性质相同、厚度相等的 吸收池分别盛待测溶液和参比溶液。156朗伯比尔定律又称比尔定律、比耳定律、布格-朗伯-比尔定律，是光吸收的基本定律，适 用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质，包括气体、固体、液体、分子、原子和 离子。比尔-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。朗伯比尔定律阐述为：光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关；在光 程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。朗伯比尔定律数学表达式A=lg（1/T）=KbcA为吸光度，T为透射比，是透

16、射光强度比上入射光强度K为摩尔吸收系数. 它与吸收物质的性质及入射光的波长久有关。c为吸光物质的浓度b为吸收层厚度。Lorwy法实验材料和用具2.1仪器与试剂试剂：无水碳酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾、硫酸铜、福林酚试剂、牛血清白 蛋白（BSA）。仪器：SP-756P紫外分光光度计。常用玻璃器皿：量筒、试管、玻棒等。2.2实验步骤2.2.1溶液配制：（1）4%碳酸钠溶液称取4g无水碳酸钠，加水溶解使成100ml。（2）0.8氢氧化钠溶液称取0.8g氢氧化钠，加水溶解使成100ml。（3）0.1mol/L酒石酸钾称取2.35g酒石酸钾，加水溶解使成100mL。（4）0.04mol/L硫酸铜溶液称取1g

17、硫酸铜（CuSO45H2O）,加水溶解使成100mL。（5）碱性铜试剂取试剂4%碳酸钠溶液、0.8%氢氧化钠溶液各25mL，试剂0.1mol/L酒石酸 钾、0.04mol/L硫酸铜溶液各0.5ml混合配制而成。2.2.2蛋白标准溶液的配制将标准蛋白质贮备液（1mg/ml）稀释成100yg/ml的标准工作液。2.量取标准工作液（双份）0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别加入刻度试管中, 补水至1ml。试管号空白（2管）1、23、45、67、89、10蛋白量（yg）020406080100标准蛋白质溶液量（yl）02004006008001000超纯水量（yl）1000

18、8006004002000蛋白标准溶液配置表12.2.3操作步骤精密量取供试品和阳性对照1.0ml （双份）于刻度试管中；吸取1.0ml纯化 水作为空白对照。加碱性铜溶液5.0ml到每一管中，涡旋混匀，室温条件放置10分钟。加酚试剂0.5ml，摇匀，室温放置30分钟。使用紫外分光光度计在650nm处用空白对照调零后，测定标准溶液的吸光 度值，以及供试品和阳性对照的吸光度值。根据标准蛋白浓度和其对应吸光度的 标准曲线，计算供试品和阳性对照的蛋白含量。紫外-可见分光光度法（增加分光光度计的图片）是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立 起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。波长 长（频率小）的光线能量小，波长短（频率大）的光线能量大。分光光度测量是 关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线，称为吸收光谱 或吸收曲线。紫外-可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收 波长（九max）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或 价电子的结构（或成键、非键和反键电子）有关。朗伯-比