离子交换层析柱子的选择

1、离子交换层析技术离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离 和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。（一）原理在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为 阴离子交 换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了 DEAE，含有 带正电荷的阳离子纤维素一O C6 H14N +H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴 离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纤维素。

2、纤 维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素一 O CH2-COO -），其反离子为阳离子（如 Na+等），可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0,当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋 白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距 蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程 度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和 球蛋白。在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于 等 电点时，蛋白质被阳离

3、子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不 同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离 开来。交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl ）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一 个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl -的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗 脱，当Cl -浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种 方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时， 抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子

4、交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低 了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换 剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。（二）常用离子交换剂的种类与特性离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1 1所示。表1-1离子交换剂的类型与特点交换剂名称（纤维素）作用基团特点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE +-O-C2H4N+ (C2H5) 2H最常用在PH8.6以下三乙氨基乙基DEAE +-O-C2H4N+ (C2H5) 2H氨乙基AE +-O-C2 H4-N H2胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂

5、羧甲基CM -O-CH 2-COO 最常用在PH4以上磷酸P-O- P O2-用于低pH磺甲基SM -O-CH 2-SO3-磺乙基SE -O-C2H 4-SO 3强酸性用于极低pH在交换纤维素中，最常用的是DEAE 一纤维素和CM纤维素。由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表 1 2）。表1-2商品DEAE 一纤维素和C M纤维素的类型和特性纤维素形状长度交换当量（毫克当量/克）蛋白质吸附容量（mg /g牛血清白蛋白）床体积（

6、ml / g ）pH 6.0pH 7.6DE-22改良纤维124001.0 0.14507.77.7DE-23改良纤维（除细粒）184004508.39.1DE-32微粒型（干）24636606.06.7DE-52微粒型（湿）24636606.06.3DE-11旧型号50250130与以上相应型号同溶菌酶PH5CM-220.6 0.066007.77.7CM-236009.19.1CM-321 2606.86.7CM-521.0 0.11 2606.86.7离子交换纤维素的优点为：离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；

7、具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。离子交换交联葡聚糖离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表 1-3。表1-3常用交联葡聚糖的类型与特性类型性能离子基因反离子总交换容量（毫克当量/g）DEAE-sephadexA-25弱碱阴离子交换 性、剂DEAE +Cl3.5 0.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱碱阴离子交换 性、剂QAE+Cl3.0 0.4QAE-sephadex A-50CM-A- sephadex 25弱碱阳离子交换 性、剂CM+Na4.5 0.5CM- sephadex A-

8、50SP- sephadex A-25强碱阳离子交换 性、剂SP+Na2.3 0.3SP- sephadex A-50离子交换交联葡聚糖有如下优点：不会引起被分离物质的变性或失活；非特异性吸附少；交换容量 大。离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000） 一般选A贝和 C50，而低分子量（V 30 000和高分子量200 000）均宜选用A25和C25。（三）试验方法阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分 溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。剂型的选择 根据蛋白质在所用

9、缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离 子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分 离碱性蛋白质。下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法 膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml8ml柱床体积 表14分离的血清与所需DEAE 一纤维素量及其他条件的大致关系血清样品量（ml ）DEAE需用量（g）血清样品量（ml ）DEAE需用量（g）选层析柱规格（cm）选脱液量（ml ）1

10、21X25100150552X1220030010102X2030040020202X37400800称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE 一纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左 右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性 为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH 液中，同样处理，洗至中性。平衡 将DEAE 一纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待 纤 维素下沉后，倾去上清液或

11、抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相 近 时为止。装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10：120：1，柱的内径上下 要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料 管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的 气泡。再将平衡的DEAE 一纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧 开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓

12、冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面 层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱 床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面， 以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平 衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4。0 平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸 管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不 要打乱纤维

13、素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml2ml缓冲液冲洗 柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。样品的加量与DEAE 一纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯 度。经过粗提的一球蛋白50mg100mg，用干重约4g DEAE 一纤维素装柱分离，可获得理想结果。洗脱 对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使pH逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。一般的办法，是稳 定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。表1 5血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系成分等电点DEAE吸附能力解吸顺序白蛋白4.9后5.65.17.3先表1 6血清的分段洗脱成分NaCl 浓度(Mol/L )0.01Mol/L PB ( pH)洗脱部分0.0258.0IgG0.0307.0IgG0.0407.0运铁蛋白、纤维蛋白原0.0606.5白蛋白、IgA0.1506.5IgM白蛋白表1 7各种Ig解脱吸附条件不加NaCl PB离子强度（Mol/L ）pHIg其他0.018.0I