阿霉素对人胆管癌细胞株FRH0201的生物学特性的影响

1、阿霉素对人胆管癌细胞株FRH0201的生物学特性的影响【关键词】胆道肿瘤阿霉素肿瘤细胞,培养液细胞周期细胞大小A125A19【摘要】目的：观察阿霉素长时间作用对胆管癌细胞株FRH0201生物学活性的影响。方法：用2g/l的阿霉素同一浓度逐渐延长时间作用于人胆管癌细胞株FRH0201细胞，经反复作用挑选出能在含1g/l的阿霉素培养液中生存72h，去掉阿霉素后仍能继续稳定传代生长的细胞。无药培养1月后进展生物学行为的监测。观察细胞形态学，绘制生长曲线和流式细胞仪测定细胞周期，酶联免疫吸附法测定细胞的肿瘤标记物，激光共聚焦显微镜观察细胞内的阿霉素的荧光强度。结果：阿霉素作用后FRH0201细胞形态学

2、有轻度改变，细胞倍增时间较亲本细胞延长3h，与亲本细胞相比S期细胞增多16.89%，G1期细胞减少29.33%、G2期细胞增多12.46%。A125和A199试验组和亲本组分别为9.14和8.60U/l，1.59和2.96U/l，细胞内阿霉素浓度荧光强度平均值，亲本细胞为1764.8，试验组细胞为305.4。结论：阿霉素对胆管癌细胞株FRH0201的形态学及倍增时间无明显影响，但使细胞进入S期、G2期的增多，细胞内药物浓度明显降低，生长时间无明显变化。【关键词】胆道肿瘤阿霉素肿瘤细胞，培养液细胞周期细胞大小A125A199Theeffetsfadrayinnthehuanliverhilarh

3、langiarinnaelllineFRH0201【ABSTRAT】bjetive:TinvestigatetheeffetsfadrayinnelllinefFRH0201.ethds:Huanhilarhlangiarinnaelllineereulturedithadrayin(2g/l)thrughlastingdifferentties,finallythiselllineansurviveafter72hulturedintheultureliquidiththeadrayin(1g/l).Thentheediuasreplaedithafreshneithutadrayin,an

4、dtheellserentinuuslyulturedfr1nth.Theinvitrstudiesinludedthebservatinftheappearaneithptialirspe,TTellprliferatinassay,analysisftheellylebyFlytetry(FAS),assaysfturarkerusingenzyelinkediunsrbentassay(ELISA),thefluresenedensityfadrayin.Results:paredttheparentFRH0201ellline:Therphlgyshedtypialrphlgialha

5、rateristis,thedublingtieprlngedabut3h,theellylebyflytetryidentifiedinG1,G2andSphasefellyleere40.50%,19.74%and39.77%intrialgrup,and69.83%,7.29%and22.88%inparentgrup,respetively.Turarkerhasndifferenebeteenthe,thefluresenedensityfepirubiindesending5.2ties.nlusin:Theadrayinanaffettheellyleandausethehang

6、efetablis.【KEYRDS】BiliarytratneplassAdrayinTurells,ulturedellyleellsizeA125A199目前，肝门部胆管癌手术切除率已明显进步，手术病死率明显下降，但真正到达根治性切除的病例很少，部分复发率很高，现有的化疗及放疗未见明显的效果。其原因可能与肝门部胆管癌的生物学特性有关1。为此，我们观察阿霉素长时间作用对胆管癌细胞株FRH0201生物学活性的影响。1材料和方法1.1材料阿霉素购于深圳万乐公司，TT购自爱博生物工程，胎牛血清购自杭州四季青公司。胆管癌细胞株FRH0201由本课题组吴小鹏教授构建2。1.2方法采用浓度一样不断增加作

7、用时间的方法确定阿霉素培养液终浓度为1g/l。首先分别向FRH0201细胞株的培养瓶内参加不同浓度的阿霉素Adrayin,ADR，培养3d后观察细胞死亡情况。结合阿霉素的血浆浓度，选择可将50%的细胞抑制的药物浓度I50作为耐药细胞培养的起始浓度2g/l，将肿瘤细胞置于该培养液中和不含药物的10%小牛血清RPI1640培养液培养，待细胞稳定生长、进入对数生长期后，传代两次，再将挑选出的细胞在一样药物浓度培养液中继续培养。经过1，2，3，6，12，24，36，48，60，72h10个时间段约8个月的培养，最终使细胞可以在1g/l阿霉素培养液中持续稳定生长并传代，然后脱药培养1个月在检测细胞的生物

8、特性。1.3观察指标1.3.1形态学观察将两株细胞分别爬片后经HE染色，光镜下进展形态学观察。1.3.2细胞倍增时间的测定取对数生长期的亲本细胞即未用药的细胞和阿霉素作用的细胞与试验组细胞各一瓶，0.25%胰蛋白酶消化，10%小牛血清1640培养液制成浓度为1104个/l的单细胞悬液，96孔板中每孔接种2001，37、5%2饱和湿度孵箱中培养。每天取3个复孔计数活细胞，计算平均值，连续观察7d。以培养时间为横轴，以细胞数的对数为纵轴，绘制半对数细胞生长曲线，于生长曲线上对数生长期内取3组数据，根据最小二乘法进展直线回归，在直线上任取两点Nt、N，根据以下公式计算细胞的倍增时间(Td3。T代表N

9、Nt的时间Td=TIg2/Ig(Nt/N1.3.3细胞周期分析取对数生长期的亲本及实验组细胞各1106个/l，制成单细胞悬液，按试剂盒说明进展操作，于流式细胞仪F上行细胞周期分析。1.3.4肿瘤标记物A125、A199分别将同等数量的亲本及试验组细胞接种于培养瓶内，37、5%2饱和湿度孵箱中培养。待细胞进入对数生长期后，分别搜集培养液各10l，1000r/in离心5in后取上清，用酶联免疫吸附法进展A125及A199的检测。转贴于论文联盟.ll.1.3.5激光共聚焦显微镜检测将亲本细胞与试验组细胞制备单层细胞爬片。将载玻片置于培养皿中10%小牛血清1640培养液制成浓度为1104个/l的单细胞

10、悬液，待细胞贴壁生长均匀布满载玻片后参加2g/l阿霉素作用30in，PBS洗涤细胞2次，在磁共振共聚焦显微镜下观察细胞内的阿霉素浓度以荧光强度表示。然后计算平均值。2结果2.1形态学改变倒置显微镜下对数生长期的FRH0201细胞呈铺路石状镶嵌严密排列，细胞呈多边形、梭形、圆形、不规那么形、三角形等各种形态，生长活泼，细胞体积变大，折光性差，核浆比例变大，细胞核增大。有多核细胞，有异常核分裂相。2.2细胞倍增时间实验组细胞倍增时间为23.6h，延长了约3h。2.3细胞周期分析实验组细胞与亲本细胞相比：S期细胞增多16.89%，G1期细胞减少29.33%、G2期细胞增多12.46%。见图1、2。2

11、.5激光共聚焦显微镜检测细胞内的阿霉素浓度以荧光强度表示，计算平均值。见图3。3讨论肝门胆管癌及胆囊癌术后化疗是重要的辅助治疗手段，但化疗的敏感性不高。且可能存在个体性差异及可能诱发的肿瘤多药耐药性。为了临床及根底方面对胆道恶性肿瘤综合治疗的研究，FRH0201细胞代表原发灶的所有细胞群体2，并已成功建立裸鼠动物模型3、4，我们用阿霉素对该细胞株进展干预，观察对其生物学特性的影响。为了更接近临床胆管癌化疗反复间歇用药的特点，对FRH0201细胞采用大剂量反复间歇同一浓度不同时间暴露，历时8个月，获得了稳定生长的细胞。本次试验不同于其它耐药株固定药物浓度，这更符合临床用药方式。在本实验中我们发如

12、今低氧时，肿瘤细胞在含有阿霉素的培养基中可以继续生长繁殖，一旦更换培养基后同样剂量的药物，细胞虽然可以继续贴壁伸展。但药物持续存在时却出现凋亡细胞，随着作用时间的延长，凋亡细胞逐渐减少。该细胞生物学特性的研究将为下一步耐药株的建立，讨论胆管癌耐药机理及逆转耐药奠定基矗以往研究发现，与亲本细胞株比拟，耐药细胞株在形态、构造及代谢程度等方面均发生了显著变化5。本实验细胞在无药培养1个月后生长稳定，倍增时间稍有延长，其分泌的肿瘤标记物如A125、A199较亲本细胞有所降低，这可能与药物抑制细胞活性有关，也可能是药物导致了细胞的分化有关，但是细胞排泄毒性药物的作用得到了增强。我们推测这些生物学性状的改

13、变与其耐药表型亲密相关，但其详细机理尚有待进一步研究。经流式细胞仪分析发现，药物处理前后试验组G1期细胞比亲本组约减少29.33%，G2期细胞比亲本组增加12.46%，S期细胞增多16.89%，说明细胞通过细胞周期限制从G1期进入S期，然后阻滞于G2期，G2期的主要特征是RNA的合成和染色质的螺旋化，此期对外界环境敏感，易受各种因素的影响6。提示根据药物对胆管癌细胞周期各期的影响，在临床上可以更好地选择不同的化疗药物，结合用药以增加疗效，减少副作用。在经药物作用挑选后1月，细胞内抗肿瘤药物浓度仍明显降低，证明了细胞稳定表达了某种机制，该机制可以使肿瘤细胞耐受阿霉素的杀伤作用，但详细的机制需要进

14、一步证实。本实验提示：1通过适当剂量的间歇的持续的冲击应用抗肿瘤药物，可以挑选出持续生长的细胞；2胆管癌细胞在阿霉素作用下，细胞内的抗肿瘤药浓度下降，这是肿瘤细胞在含抗肿瘤药物的掊养液中生长繁殖的根底；3阿霉素可以影响细胞的分裂增殖周期。但该结论尚需今后进一步实验得以证实。参考文献1丛文铭，吴孟超，陈汉.肝内胆管癌多基因变异表型分析J.中华医学杂志，2001，81：271273.2JkbyB.ethdsinenzylgy.NeYrk:AadPress，1979.150.3吴小鹏，王占民，何晓冉.肝门部胆管癌细胞系FRH0201的建立及生物学特性研究J.中华医学杂志,2022,85(25):17841785.4李志伟，王占民，吴小鹏，等.利用裸鼠建立人肝门部胆管癌肝门移植模型J.中国现代普通外科进展,2022,74:209.5UhiyaaKkubuN,atanabeT.Establishentandharaterizat