2016《植物生理学实验》

1、2016植物生理学实验植物S0酶活性的测定、实验目的学习掌握用氮蓝四瞠(NBT)法来测定植物超氧化物歧化(superoxie ismutase, 的活力了解不同盐浓度胁迫关于水稻幼苗叶片SO酶的影响。二实验原理SO发现:1938 Mani 等人首次从牛红血球中分离得到SO。SO分布:广泛分布在各种生物体内，其活性高低可作为抗衰老的指标。SO类型：0SO是含CuZn、Mn、Fe金属元素、能清除超氧阴离子由基的,其类型有Cu/Zn-SO Mn-SO Fe-SO0MAProteins U0盐胁迫关于植物叶片SO酶的影响在一定盐度的胁迫下，植物叶片中SO升高而增强。SO此，盐胁迫的损伤在一定范围内是可

2、以修复。然而，膜系统的修复与SO、CAT、PO 等抗氧化酶的 活性和抗坏血酸(ASA)、谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物含量的 变化密切相关。SO测定方法直接法：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法、核磁共振法。间接法（化学法）:邻苯三酚自氧化法、细胞色素C 还原法、轻胺法、黄嚓吟氧化酶-NBT 法、肾上腺素法等。免疫法：放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA 法等。超氧阴离子自由基寿命短，不稳定，不易直接测定SO 活性， 因而采用间接法测定。3 种：邻苯三酚自氧化法、化学发光法。酶活性的原理在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，还原的核黄 素极易再氧化而产生氧自由基，可将氮蓝四瞠还原为蓝 甲腺，

3、560nm处有最大吸收。而SO可清除 氧自由基，从而克制了甲腺的形成。光还原反映后，反映液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。酶单位/样本量=7x区座被克制-3（50%）x3加反映混合液中加入的样本量核黄素：在有氧物质存在下，还原的核黄素与氧反映产 生氧自由基。氮蓝四哩(NBT):NBT 蓝色甲腺。甲硫氨酸：提供核黄素的还原反映所需的电子供体，使 得核黄素的光激发还原反映得以进行。SO酶：SO经过催化氧自由基歧化反映，生成与H2O2,从而克制蓝色甲腺形成。SO 催化反映如下:O； + O； + 2H+ SOH2O2+O2二、实验材料、仪器与试剂材料：水稻幼苗盐胁

4、迫处理后的叶片。仪器设备：电子天平，高速台式离心机，分光光度计，移液器, 荧光灯（4000Lx）等。试剂：SO 抽提液：50mmol/L（pH7.8）14.5mmol/L（Met）溶液：现配现用。2.25mmol/L 氮蓝四哩溶液（NBT）:避光保存，现配现用。 60 円nol/L 核黄素溶液：避光保存，现配现用。3 pimol/L ETA 一 溶液主要试剂配制（供参考）:（1）50mmol/L（pH7.8）:A液：20420（156.01）12g溶于蒸馆水，lOOmLB液：NHPOq120（358.14）17glOOmLA85mlB91.5ml400ml,pH7.8o(2)SO提取液：50m

5、mol/L0.1mmol/LETA; 0.3%(w/v)TritonX-100;2-4%(PVP20gPVP,200）110.5mol/LETA母液,3ml TritonX-100o(3)145mmol/L149.21):称2.163g溶于蒸憾水，定溶至1000ml(较难溶，需稍微加(4)2.25mmol/LNBT(分子量817.7):92mg50ml50mM(pH7.8),存。60jimol/L376.36)2.25mg50ml50mM磷酸磷酸缓冲液(pH7.8),现配现用, 避光保存。3jimol/LETA-N2372.24):、0.5mol/L称9.306g溶于蒸憾水，定容至50ml。注

6、意：搅拌用NQOH调pH至8.0才能完全溶。B、0.5mmol/LAlml1000ml。C、3giol/LB3ml500ml。三、实验步骤酶液提取0.2-0.5g置于l-2mlSO浆，并且转移到离心管中，再用提取液清洗研钵，每次lml,4ml;6000- 8000rpm5-10SO冰箱保存备用。反映体系试剂用量（ml/管）50mMSO提取液14.5mM甲硫氨酸2.25mMNBT3jiMETA-Na2JLL60M蒸馆水JLL酶液总体积1.50.30.30.30.30.250.05 取液代替酶液）3.0做预实验：以确定最佳酶液浓度酶液稀释：取其中一管酶液按1倍、10倍、100倍 稀释。混合液配制：

7、计算4-5支试管的用量，按反映体系 表各溶液（除酶液外）配制1份混合液（现用现配）。加酶液：在每支试管中加混合液2.95ml,再诀别 加入相2 关于照用提取液 代替酶液，混匀，马上用黑色塑料袋罩住。照光反映：取1支关于照管于暗处，其余放在试管架上，于4000LX20min （要求各管受光情况一致，光 照时间视具体情况而定，如光照强、温度高则时间缩短， 反之则延长，时间要严格控制）。今天实验的照光时间约25min左右终止反映：照光完毕马用黑色塑料袋罩住试管架以止反映。SO活性测定：以不照光的关于照管做空白，诀别测定各管O值。确定酶液加入量：以克制率在35%-65%为佳。正式实验准备6支相同型号的

8、试管支样本、2支关于照。混合液配制：按6-8支试管的用量配（同预实验 加酶液：各加入混合液2.95ml,4支诀别加入相关于应的酶液量，2混匀，遮光。照光反映：取1支关于照管置暗处其余各管进行照光反映，时 间预实验进调整。终止反映：照光完成后，迅速用黑色垃圾袋罩住试管架终 止反映。SO以不560 nm处的O值。结果计算一个SO酶活性单位的确定:SO50%的酶量为一个SO NBT 0560=0.5;催化歧化为H2O2和。NBT 竞争，部分克制了NBT 0560=0.25, NBT SO50%,则此时加入的酶量为一个SO酶单位。计算SO活性:SO 总活性=丄如尹SO总活比活力=XSO性 蛋白SO 总活性：以每克鲜重酶单位表示。SO/mg蛋白表示。A 样本管的吸光度；V:样本液总体积(ml);测定时样本用量(ml);W:样本鲜重(g)o蛋白质浓度单位：mg蛋白/g鲜重。五、注意事项研磨样本时提取液要分次加入，用提取液洗研钵，并且全 部转移到离心管中，控制总量不要超过 4ml。除正在研磨的样本外，其它余样本或提取好的粗酶液均 保存在冰箱备用。混合液的配制、分装及加酶液的进程中均应注意避光。做好