实时荧光定量PCR检测传代培养细胞Grb10的表达

1、实时荧光定量PCR检测传代培养细胞Grb10的表达【摘要】目的建立一种可靠的Grb10印迹基因实时荧光定量PR方法，检测传代培养鼠尾成纤维样细胞中Grb10表达的差异。方法通过实时荧光PR，选择适宜的“相对标准品绘制相对标准曲线，检测传代培养细胞中印迹基因Grb10的表达程度。结果相对标准曲线有较好的线性r=0.999及0.984；实时荧光定量PR方法检测出随着细胞培养代数的增加印迹基因Grb10表达程度上升。结论双标准曲线的实时荧光定量PR法用于检测Grb10的表达准确可靠；传代培养可能影响鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的表达程度。【关键词】聚合酶链反响；等位基因；基因表达；蛋白质类；

2、细胞，培养的；Grb10Grb10是母本等位基因特异表达的印迹基因，通过编码特殊的衔接蛋白结合酪氨酸激酶受体，调节特定的信号传递过程。印迹基因表达的一个特点是依赖等位基因的亲本来源，即优先表达来自父本或母本的等位基因1。某一亲本等位基因的沉默是通过染色体的表观遗传修饰来完成的，染色体的修饰对基因转录密不可分，主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰。因此，检测小鼠印迹基因Grb10在经体外培养后表达程度的差异，是研究培养过程中表观遗传修饰影响印迹基因Grb10表达程度的重要基矗实时荧光定量PR是近年来使用的一种核酸检测技术，因高准确度、高灵敏性、污染少等优点已在生物医学、根底科研及医学临床中得到广泛应

3、用。它是利用每一模板的T值与该模板的起始拷贝数的对数存着的线性关系，来定量模板初始拷贝数，从而实现极为准确的核酸定量检测。综合比拟实时荧光PR绝对定量和相对定量的各种方法，同时结合试验目的，笔者采用一种新的实时荧光定量PR的方法来检测印迹基因Grb10的表达，即通过适宜的相对标准品、系列稀释后构建相对标准曲线，获得与绝对定量标准曲线一致的斜率。因为定量结果只与曲线的斜率相关2，因此，可以实现比传统的相对定量法2-T法更为准确的定量结果，并且防止了绝对定量的复杂度和难度。1材料和方法1.2鼠尾成纤维样细胞培养参照文献3。剪约1鼠尾组织，消毒后用培养液反复冲洗，转移至新培养皿，剪切至约111组织块

4、，移入潮湿过的培养瓶，均匀摆布至瓶底，互相间隔 约0.5。轻轻翻转培养瓶，瓶底向上，参加1L培养液DE/F12，添加10%FBS和0.10.25%双抗，轻晃动使之分布均匀，置36.5温箱倒置培养约48h，待其组织块贴壁，再缓缓把培养瓶翻转过来，让培养液渐渐覆盖已贴附瓶底的组织块。培养约1周后，可见成纤维样细胞从组织块游离长出，适当添加培养液，获得原代成纤维样细胞。待其长满至约80%瓶底，连续传代过程中搜集P1及P5细胞。1.3总RNA的提取与DNA的合成1.3.1总RNA的提取与定量搜集P1及P5细胞，重悬、计数、离心1200r/in，5in，沉淀中参加Trizl，吹打后参加三氯甲烷，离心12

5、00r/in，5in，沉淀参加丙醇；离心1200r/in，5in，乙醇洗涤，得到的RNA用焦碳酸二乙酯DEP水溶解，用紫外分光光度计定量，-80保存。1.3.2DNA合成选择完好性良好的RNA样本，按逆转录试剂盒说明书合成DNA。20L体系中含总RNA100ng，5缓冲液4L，dNTPix10l/L2L，抑制剂(10l/L)1L，逆转录酶1L，lig(dT)1L，最后无RNA酶H2至20L。逆转录程序为：4220in995in45in，DNA放-20待测。1.4.1相对标准品构建取2g待测样本RNA逆转录成DNA，5倍系列稀释后，得到标准品梯度浓度设为1，0.2，0.04，0.008，0.00

6、16，相对标准品用于制作双标准曲线的模板。1.4.2实时荧光定量PR使用扩增仪，按照试剂盒说明书进展，在20L反响体系中含2SYBRPreixExTaq10L内含TaKaRaExTaqTHS，dNTPix，g2+和SYBRGreenI，50RXRefereneDye0.4L，上下游引物10l/L各0.2l/L，待测样本的DNA或梯度浓度的定量模板。引物大小及其序列53：Grb10315bp上游：AGAAGTTTGGA下游：AGTATAGTATAGATGATGTTGGapdh150bp上游：TGTGTGTGTGGATTGA下游：TTGTGTTGAAGTGAGGAG1.4.3PR反响条件9510s

7、955s6034s，40个循环；9515s601in9515s。各待测样本及各梯度浓度的相对标准品均做2个平行管，荧光定量分析软件自动绘制扩增动力曲线溶解曲线。通过溶解曲线分析实时荧光定量PR反响产物的纯度以判断实验的特异性。PR反响完毕后根据荧光定量分析软件，算出各待测样品的相对初始拷贝数。1.4.4验证PR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法，并于紫外灯下观察扩增片段大小及特异性。1.5统计学处理数据以(xs)表示，采用SPSSVer13.0软件。配对样本t检验。2结果2.1电泳鉴定总RNA的完好性RNA电泳可见3条rRNA条带，分别为28，18，5.8S(5S)，在紫外灯下亮度依次为28S18S

8、5.8S(5S)，且28S的亮度大致是18S的2倍，5.8S条带弱图1。可以认为所提取的RNA质量好，未被降解，可用于实时荧光定量PR分析。图1RNA的电泳结果略Fig1TheresultsfRNAeletrphresis2.2实时荧光定量PR反响1实时扩增曲线图2。S型的扩增动力曲线，有明显的指数扩增期、有平台期，并且曲线起峰约在T值为21，整条曲线走行光滑，显示扩增结果理想。2溶解曲线图3。分别显示目的基因Grb10和内参基因GapdhPR扩增后的溶解曲线，其熔点峰分别位于88.6和85.9，峰形窄而尖，无杂峰，扩增产物特异性良好。3标准曲线图4。显示5倍梯度稀释的相对标准品进展PR扩增后

9、，各自得到目的基因Grb10和内参基因Gapdh标准曲线，直线拟合度良好，斜率(slpe)分别为-3.2062和-3.4673，其直线相关系数r分别为0.9838和0.9987，直线相关性好，可在较宽广的范围内进展定量分析。横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度.图2实时荧光定量PR扩增曲线略2.3确认PR产物于315bp和150bp处可见2条明晰电泳条带，与理论值大小一致，其分别为目的基因Grb10和内参基因Gapdh，此外未见其他杂带图5。2.4定量分析结果通过内参基因Gapdh定量结果对目的基因Grb10定量值进展归一化处理后，以Grb10/Gapdh比值K表示基因Grb10表达程度，得到各样本K值见表2。体外传代培养过程中的鼠尾成纤维样细胞P1和P5，其Grb10表达程度分别为1.51010.1074和1.73260.0735，二者比拟有统计学意义P=0.042。转贴于论文联盟.ll.a：Grb10；b：Gapdh.横坐标为温度，纵坐标为荧光变化速度图3目的基因Grb10和内参基因Gapdh溶解曲线略Fig3DissiatinurvefrGrb10andGapdha：Grb10;b：Gapdh.横坐标为相对表达量对数显示，纵坐标为t值.图4目的基因Grb10和内参基因Gapdh标