温莪术内生真菌的分离及其分类鉴定

1、温莪术内生真菌的别离及其分类鉴定【摘要】目的对温莪术不同部位内生真菌进别离和分类鉴定。方法采用内生菌常规别离法对安康温莪术根、茎和叶的内生真菌进展了别离和鉴定。结果从温莪术中别离得到了99株内生真菌，经鉴定为21属，其中根部42株涉及11属，茎部12株涉及4属，叶部45株涉及12属。结论温莪术的不同部位内生真菌的数量、分布和种群存在差异。【关键词】内生真菌；别离；鉴定；温莪术IslatinandIdentifiatinfEndphytiFungifruruaaratiaSalisbAbstrat：bjetiveTislateandidentifytheendphytifungifdiffere

2、ntpsitinsinuruaaratiaSalisb.ethdsEndphytifungiereislatedfrhealthyrts,stesandleavesfuruaaratialSalisbandidentifiedithnventinalethd.ResultsNinty-ninestrainsfendphytifungibelngt21genusereislatedandrhplgiallyidentifiedfruruaaratiaSalisb.Frty-tstrainsf11generaereislatedinrts,12strainsf4generainstes,and45

3、strainsf12generainleaves.nlusinThequantity,ppulatinanddistributinftheendphytifungiarevariusindifferentpsitinfuruaaratiaSalisb.Keyrds：Endphytifungi；Islatin；Identifiatin；uruaaratiaSalisb植物内生真菌(EndphytiFungi)是存在于安康植物组织、器官内，并不引起明显病害病症的一类真菌1。植物与真菌的共生现象在生物进化过程中历史悠久而又极其普遍。虽然人们很早就知道内生真菌的存在，但直到1977年才对其重要性有所认

4、识2。通过二十多年的研究，人们发现，作为地球上一类古老而又普遍的共生生物，植物内生真菌不仅可以提供人类丰富的药用性次生代谢产物3，而且有可能从整体上参与和协调植物与环境因子(包括病原微生物)的互作过程，从而对植物的抗逆性和环境适应性产生积极的影响4。温莪术为姜科植物温郁金uruaenyujinY.H.henet.Ling的枯燥根茎,其味辛、苦,性温。具有行气破血、消积止痛的作用5。含有莪术油、姜黄素、多糖、木脂素类、脂肪酸类及微量元素等多种不同生物活性的化学成分6。现代药理研究说明,温莪术具有抗肿瘤、抗血栓、抗菌、抗病毒等作用,对呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统、循环系统疾病和皮肤溃疡都有较好

5、的疗效7。由此，人们对它的关注也由来已久。但至今对温莪术内生真菌的研究报道还很少，假如能在温莪术内生真菌中可以发现类似的活性物质，无疑找到了一种可替代温莪术植物的新型生物资源，为此本实验对温莪术内生真菌进展了系统的研究。现将温莪术内生真菌的别离鉴定结果及种群分布报道如下。1材料1.1材料别离所用植物材料为温莪术根、茎、叶，采自温州医学院莪术种植基地不同生长时期的温莪术，无病虫害。1.2培养基内生真菌别离培养基为PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000l)和A抗生素培养基(琼脂20g，氨苄青霉素200g，链霉素200g，水1000l)；纯化鉴定培养基为PDA培养基和查氏

6、培养基蔗糖30g，NaN32g，Kl0.5g，gS47H20.5g，FeS40.01g，K2HP41g，琼脂1520g，水1000l。2方法2.1内生真菌的别离取温莪术的根、茎、叶，用刀切成23的小块，按以下步骤进展外表消毒：自来水冲洗干净，75%的酒精漂洗12in，无菌水冲洗3in，0.1%的升汞漂洗1020s，无菌水冲洗45次。上述处理过的样品，在无菌状态下切割成约0.50.5的小块(片),分别置于已倒好的A抗生素平板培养基和PDA平板培养基上，放置在28条件下。2.2内生真菌的纯化接种物培养37d后，观察皿中材料切口处长出菌丝(菌落)，挑取切口处菌丝尖端转接到新的PDA平板上，待长成菌落

7、后，根据菌落形态、颜色的差异及长出时间的不同，分别挑取其边缘的菌丝进展别离培养，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应记录。采用菌丝顶端纯化法如此反复纯化后，转入PDA斜面培养基上，于28培养箱中培养57d后，对菌株进展编号，并放入4冰箱保存。2.3菌种的鉴定采用直接挑取制片法和插片培养法，观测菌种在培养过程中菌丝、个体发育、产孢构造和孢子形态等特征，对别离得到的内生真菌进展显微形态观察、分类鉴定811。3结果3.1别离方法的比拟本实验过程中尝试了组织研磨涂平板和组织切片别离两种方法。结果说明研磨法的优点是能获得较多菌株，但外表消毒验证效果不佳，且菌株不易纯化；而组织切片培养的方法操作

8、简单，外表消毒验证效果可靠，菌株易纯化。为此本研究最终选择了外表消毒后组织别离培养的方法。转贴于论文联盟.ll.3.2温莪术内生真菌的别离及分类鉴定结果从温莪术根、茎、叶组织别离中,共获得内生真菌99株。结果见表1。表1温莪术内生真菌的别离鉴定结果略从表1可看出，植物组织的部位不同,别离获得的内生真菌种类不同。从分布上来看，99株内生真菌中，根局部布42株内生真菌，占总菌株数的42%，11个属，占21个属的52%；茎局部布12株0内生真菌，占总菌株数的12%，4个属，占21个属的19%；叶局部布45株内生真菌，占总菌株数的45%，12个属，占21个属的57%。由此可见，温莪术内生真菌主要存在于

9、植株的根和叶中，茎部相对较少。3.3温莪术内生真菌的种群组成从温莪术不同组织中别离得到的99株内生真菌，经显微形态观察，初步鉴定为5目、6科、21属，另外，还有9株不产孢，为无孢菌群见表2。表2温莪术内生真菌的种群组成略由表2可知，温莪术内生真菌以镰孢霉属为优势种群，约占总数的13%；其次为曲霉属和青霉属，约占总数的10%；此外，无孢菌群在其内生真菌中也占有较大的比例。从表中可见温莪术内生真菌最明显的特征是在种类组成上具有多样性。4讨论在内生菌的别离过程中，进展外表消毒时,0.1%升汞的漂洗时间不能长,尤其是对于幼嫩的叶片消毒时间要比根茎更短,否那么别离到的菌落少,甚至会把内生菌全部杀死。所别

10、离的真菌在查氏培养基上一般生长较缓慢,在马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上生长较快,许多真菌在PDA上有色素产生,而在查氏培养基上无色素产生。PDA营养比拟齐全,所以培养效果好,生长快,这主要是营养条件决定的,因此，我们培养真菌一般用营养条件好的PDA,而在鉴定时一般用查氏培养基,因查氏培养基成分清楚,干扰小,在其上生长时真菌的各种鉴定的特性更易显现出来。从温莪术根、根状茎、茎、叶等部位别离到99株内生真菌,说明该植物体内伴生微生物的多样性比拟丰富,植物内生真菌一方面表现出能与植物互相协调生活与植物形成共生关系,另一方面有些真菌也为植物病原菌,平时不引起植物发病,但它们对于无病症寄主而言仍存在一定

11、威胁性,不同的微生物能互相作用,并建立一种平衡,在植物体内形成一种相对稳定的真菌菌群,其中一些是别离频率高,数量大的优势菌种,而另一些属于稀有菌种。通过对温莪术不同部位的内生真菌的别离,发现植物组织和部位不同,别离获得的内生真菌种类不同。温莪术不同组织别离内生真菌的频率顺序为叶片根茎,说明内生真菌在温莪术不同部位的分布不同。研究结果说明,对于别离率较高的镰孢霉属和曲霉属在根茎叶中都可以别离出，显示它们可以系统性分布于宿主中，而顶毛单胞霉属和星刺壳孢属仅分布在茎部，其余各属均分布在根和叶部。这一结果说明一些内生真菌可能具有一定的组织专一性。植物内生真菌和其宿主之间存在复杂的生物化学互相作用,植物

12、形成的某些次生代谢产物可能就是内生真菌转化宿主组织中的前体物质所形成,本研究为进一步讨论植物与内生真菌的互相关系提供了重要的资料。【参考文献】1尹建雯，陈有为，李治滢，等.芦荟植物内生真菌的研究抗菌活性初探J.微生物学杂志，2022，24(2)：30.2陈晖奇，徐焰平，谢丽华,等.茶树内生真菌的别离及其在寄主组织中的分布特征J.莱阳农学院学报(自然科学版)，2022，23(4)：250.3邹文欣，谭仁祥.植物内生真菌研究新进展J.植物学报，2001，43(9)：881.4RdriguezRJ,RedanRSandHensnJTherleffungalsybisesintheadaptatinfplantsthighstressenvirnentsJ.itigatinandAdaptatinStrategiesfrGlbalhange，2022，9：2615国家药典委员会中国药典,部S.北京:化学工业出版社，2022：194.6胡润淮,邵清松.温郁金化学成分研究进展J.时珍国医国药，2022，187：1773.7李国栋，许付，沈爱军.莪