中草药DNA条形码分子鉴定：从基因到基因组

1、中草药 DNA条形码分子鉴定：从基因到基因组鉴定中药的“真伪优劣”是确保中药质量的关键所在, 而其中“真伪”更是中药临床用药安全的重要前提, 特别是针对贵重药材以及有毒中药而言。DNA条形码作为一项快速准确鉴定物种的方法在药用植物基原以及药材鉴定中的应用已非常广泛。通过构建标准的 DNA条形码参考数据库是该技术应用的主要形式。尽管不同学者提出了诸多用于植物鉴定的DNA条形码 , 但由于片段长度的限制 , 单一序列或多序列组合的条形码在近缘种之间的鉴定仍有很大的局限性。植物叶绿体基因组作为用于筛选DNA条形码序列的研究热点 , 其本身也可作为超级条形码 (Super barcode)用于系统进化

2、、亲缘关系以及物种鉴定研究。本研究围绕 DNA条形码鉴定技术 , 首先以日本药局方 ( 以下简称“药局方” ) 中收载的生药材为对象 , 构建了药局方生药DNA条形码分子鉴定系统； 其次 , 选取人参属药用植物作为名贵药材代表、乌头属药用植物作为有毒中药代表, 分别对该技术在这两个属中的应用进行了研究；最后, 利用高通量测序技术测定了乌头属叶绿体基因组 , 为叶绿体基因组作为超级条形码奠定基础, 为筛选适合该属的高变异分子标记提供依据。本研究主要内容及结论如下：1、建立了一套以 ITS2 序列为主 psbA-trnH序列为辅的汉方生药材标准DNA条形码数据鉴定系统。 该系统为用户提供了汉方草药

3、信息查询、 DNA条形码物种鉴定以及从样品采集到数据分析的标准操作流程三项主要功能。共搜集来自日本及中国不同地区的基原植物和生药材样本共计576 份, 从中获取的标准序列覆盖了97.3%的药局方 ( 十六版 ) 收载生药品种。另外搜集了100份待测样本 , 用来检验数据库的鉴定效果。通过 BLAST结果显示 ,100 份样品中有 71 份样品获得的结果与标签上所标注的物种一致 , 即准确鉴定到物种水平。其余29 份样品鉴定到属水平。本课题建立了全世界首个国家级药品法典的DNA条形码分子鉴定在线平台,为全世界其它如中、美、韩等国家的药典提供示范作用。2、采用 ITS2 序列对人参属药用植物的SN

4、P位点 (single nucleotide polymorphism)进行研究 , 发现五个稳定的可作为独特标记用来区分人参属不同物种以及人参西洋参混合粉末的种间变异位点。同时 , 针对人参属 ITS2 序列的基因组多拷贝进行变异分析, 发现 ITS2 序列在基因组内变异较小时 , 其在该种的种内变异也较小, 反之亦然。再者 , 使用三个常用 DNA条形码 (ITS2 、psbA-trnH 和 matK), 共计 377 条序列 , 对人参属药用植物的种内变异情况进行了分析 , 发现这三条序列在人参、 西洋参和三七中的变异较低 ,呈现出高度保守的趋势 , 而在竹节参中的变异相对较大。本课题首

5、次借助 SNP位点鉴定人参、西洋参混合粉末, 实现了基于 DNA条形码方法的人参属珍稀濒危物种及名贵药材的快速准确鉴定。3、对乌头属 19 个物种的 52 份样品的 ITS、ITS2、psbA-trnH 以及 matK序列进行扩增和测序 , 比较候选序列的扩增及测序成功率、种内种间遗传距离、barcodinggap 分析 , 构建系统发育树用以评估它们在乌头属物种中的鉴定能力。结果显示 ,ITS 和 ITS2 序列在扩增及测序成功率上表现最优, 均为 100%。psbA-trnH 序列次之 ,matK 由于长度较长且含有poly 结构 , 致其扩增和测序成功率较低。除此以外 ,ITS 及 IT

6、S2 序列在遗传距离、 barcoding gap分析上都较其余两个候选序列有明显优势。 通过 BLAST方法显示 ITS 序列在该属的鉴定成功率最高(57.9%), 构建的系统发育树也显示基于ITS 序列的乌头属物种呈现的单系性比例最高 (57.9%) 。综合上述结果 , 针对本研究所涉及的乌头属物种,ITS 序列的表现最为突出 ,更适合用于该属物种的鉴定。4、利用高通量测序技术测定了乌头属北乌头(Aconitum kusnezoffi)、牛扁 (Aconitum barbatum var.puberulum)以及露蕊乌头 (Aconitum gymnandrum) 的叶绿体基因组 , 共含有 130 个独特的基因 , 其中包含84 个蛋白编码基因 ,38 个 tRNA和 8 个 rRNA。通过对它们的比较分析发现大单拷贝区和小单拷贝区的变异大于两个反向重复区。本研究首次测定了植物界中毛茛科乌头属的叶绿体基因组, 为其在乌头属系统进化以及物种鉴定等领域的研究提供数据支持。5、利用 ClustalW2 中的多序列比对功能对乌头属叶绿体基因组的基因以及基因间隔区进行了相似度比较, 并从中筛选出了十个变异程度较高的基因间隔区。将筛选出的十个高变异