博士后出站研究报告

1、分类号_密级_U D C_编号_南方医科大学博士后研究工作报告结构及功能性鉴定与类风湿关节炎相关的二型胶原蛋白特异性、HLA-DRB1*0405 限制型 T 细胞表位Functional and Structural Characterization of anHLA-DRB1*0405-restricted T cell Epitope from Type II Collagen Relevant toRheumatoid Arthritis张娜茹工作完成日期2015 年 7 月至 2017 年 12 月报告提交日期2018 年 1 月南方医科大学（广东）12018 年 1 月2结构及功能性

2、鉴定与类风湿关节炎相关的二型胶原蛋白特异性、HLA-DRB1*0405 限制型 T 细胞表位Functional and Structural Characterization of an HLA-DRB1*0405-restricted T cellEpitope from Type II Collagen Relevant to Rheumatoid Arthritis博士后姓名：张娜茹流动站（一级学科）名称：药理学专业（二级学科）名称：抗炎免疫药理学研究工作起始时间2015年 7 月 1 日研究工作期满时间2017年 12 月 31 日南方医科大学人事部（广东）2018 年 1 月3内容

3、摘要类风湿关节炎（RA）是由 T 细胞介导的与人类主要组织相容性复合物 II 类分子（MHC II）密切相关的一种自身免疫性疾病。位于东亚地区的类风湿关节炎患者约 30-40%携带 HLA-DRB1*0405 等位基因。截至目前，二型胶原蛋白（CII）被认为是引发该疾病的主要自身抗原之一，然而该蛋白的 T 细胞表位及它是如何与 HLA-DRB1*0405 分子结合进而相互作用的尚未被科研工作者报道。通过多肽竞争结合实验，我们发现了一条来源于 CII 的多肽 hCII931-949 与HLA-DRB1*0405 分子具有很高的结合力,然而已被证实的 HLA-DRB1*0401 分子的 T 细胞表

4、位 hCII259-273 并不能结合 HLA-DRB1*0405 分子。经过 E266L位点的氨基酸替换 hCII259-273_E266L 与 HLA-DRB1*0405 分子的结合力大幅度增强。我们进一步证实了 hCII931-949 与 HLA-DRB1*0405 分子的主要结合位点并得到了 DRB1*0405-hCII931-949 的晶体结构。 CII 特异性，HLA-DRB1*0405 分子限制型 T 细胞表位的鉴定为类风湿关节炎疫苗的研发和临床应用奠定了科学基础。关键词：类风湿关节炎，主要组织相容性复合物，HLA-DRB1*0405, 二型胶原蛋白，T 细胞表位，4Abstra

5、ctRheumatoid arthritis is a T cell dependent autoimmune disease with a strong association with the major histocompatibility complex class II (MHC II) gene. Up to30-40% of the East Asian RA patients possess HLA-DRB1*0405 allel which is associated with the disease. A joint protein that has been sugges

6、ted to play a role in the onset of arthritis is type II collagen (CII) but it is so far unknown how the relevant peptide is bound and recognized when presented by HLA-DRB1*0405 allele. We have now identified how hCII931-949 peptide from human CII binds to the HLA-DRB1*0405 allele by competitive pept

7、ide binding assay and crystal structure. The DRB1*0405 molecule was found to bind the hCII931-949 peptide but with dramatically reduced affinity to the well identified HLA-DRB1*0401 T cell epitope hCII259-273. The E266L amino acid substitution at P4 pocket of the hCII259-273 peptide increased the bi

8、nding affinity with HLA-DRB1*0405 molecule.The key residues that are important for HLA-DRB1*0405 binding were identified.Furthermore, we got the crystal structure of HLA-DRB1*0405 complexed with hCII931-949 peptide. The CII-specific, HLA-DRB1*0405 restricted T cell epitope identification might lay a

9、 scientific foundation for the RA vaccine development and clinical use.Keywords: Rheumatoid arthritis; MHCII; HLA-DRB1*0405; type II collagen (CII);5T cell epitope6目次1.91.1类风湿关节炎的研究意义91.2类风湿关节炎的国内外研究现状111.2.1类风湿关节炎的遗传因素111.2.2类风湿关节炎的自身抗原及其 T 细胞表位122.实验材料与方法142.1 实验材料142.1.1 实验试剂与耗材142.1.2主要仪器152.2 实

10、验方法162.2.1 E.coli DH5化学感受态细胞的制备162.2.2 PCEP4-DRA1*0101 及 PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut 表达质粒的构建与鉴定162.2.3质粒共转染 ExpiHEK293F 细胞以表达 DRB1*0405-hCLIPmutd 蛋白162.2.4 DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白的纯化172.2.5西方印迹法鉴定 DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白172.2.6 多肽竞争结合实验192.2.7 HLA-DRB1*0405-hCII931-949 复合物结晶及其晶体结构解析202.2.8从 RA 病人全血中提取基因组 D

11、NA202.2.9 从 RA 病人抗凝血中分离外周血单个核细胞 (PBMC)212.2.10 酶联免疫吸附实验 (ELISA)222.2.11 统计处理和分析223.实验结果与分析223.1表达质粒获得成功构建223.2西方印迹法鉴定 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白获得成功表达243.3 对影响蛋白表达量的转染条件进行饿优化243.4多肽竞争结合实验证实 HLA-DRB1*0405 分子可特异性结合 hCII931-949 多肽243.5 P-2、P1、P4 和 P8 是 hCII931-949 多肽与 HLA-DRB1*0405 分子结合的主要位点2773.6HLA-DR

12、B1*0405 分子与 hCII931-949 多肽复合物的晶体结构283.7PBMC 体外刺激实验294.讨论305.结论346.致谢357.参考文献368.结尾398图表清单1 102 203 (A-B) .234 245 246 (A-C) .266 (D) .277.288 299 309英文缩略词对照表AlanineAAntigen presenting cellAPCCollagen-induced arthritisCIACollagen type IICIIEnzyme linked immunosorbent assayELISAGlycineGGlutamineQHemag

13、glutininHAHuman leukocyte antigenHLAMajor histocomplex class IIMHC IIOptical densityODPheripheral blood mononuclear cellPBMCPhenylalanineFRheumatoid arthritisRAProlinePShared epitopeSET cell receptorTCRTheronineT10结构及功能性鉴定与类风湿关节炎相关的二型胶原蛋白特异性、HLA-DRB1*0405 限制型 T 细胞表位1.引言1.1 类风湿关节炎的研究意义类风湿性关节炎(Rheumat

14、oid arthritis, RA)是一种以慢性滑膜炎为主的自身免疫性疾病，主要影响腕部、手、膝盖、踝和脚的小关节，然而在 15-25%的患者中也可能会影响到身体的其它器官，比如眼睛、皮肤、心脏、肾脏和神经系统。截至 2016 年底，中国的 RA 患者总数高达 6000 万。RA 发病率及致残率都非常高，对人类健康造成非常严重的威胁，被称为“不死的癌症”。目前临床上采用的药物治疗主要包括非甾类抗炎药、慢作用抗风湿药（Disease-modifying anti-rheumatic drugs， DMARDs）、免疫抑制剂、生物制剂及植物药等，治疗的主要目的在于减轻关节炎症反应，抑制病变发展及不

15、可逆骨质破坏，尽可能保护关节和肌肉的功能，最终达到缓解病情或降低疾病活动度的目标。但是，众多 RA 患者使用上述药物几年后常常会出现明显的毒副作用以及耐药性，使得多数患者的病情不能得到长期有效的控制。迄今为止，没有一种药物可以完全治愈 RA，因而发现新的治疗性药物是目前研究的重点。到目前为止，RA 的病因尚未完全明确，但研究发现该疾病与遗传因素、微生物感染、激素刺激、吸烟、饮食等很多因素有关。由于 RA 是一种自身免疫性疾病，自身抗原的确定显得尤为重要。人体内存在多种关节特异性蛋白，例如：二型胶原蛋白（Collagen type II, CII）、人体软骨糖蛋白（HCgp39）、瓜11氨酸化丝

16、聚蛋白和波形蛋白等等。目前 CII 被认为是最有可能的自身抗原之一，因为该蛋白是组成透明软骨的主要成分，组成该蛋白的赖氨酸和脯氨酸位点可被羟基化继而糖基化，这种翻译后修饰的蛋白可被机体视为外来抗原，从而诱导自身抗体的产生。相关研究显示，在 RA 患者的血清和滑膜液中可检测到 CII的抗体1。而在小鼠、大鼠和灵长类胶原蛋白诱导的关节炎（Collagen-inducedarthritis, CIA）动物模型中异源 CII 可诱发 RA 疾病的产成，例如，鸡来源的 CII可诱导恒河猴和普通狨猴产生类似 RA 的症状，而大鼠来源的 CII 可使小鼠产生类似 RA 的症状2，因此，CII 目前被认为是最

17、主要的自身抗原之一。此外，在 RA 患者发炎的关节滑膜处存在大量活化的 CD4+ T 细胞，充分说明 T 细胞介导了该自身免疫性疾病的发生。其可能的机制是关节滑膜处的 CII 中某个翻译后修饰肽段被抗原递呈细胞（APC）细胞膜表面表达的主要组织相容性复合物（MHC） II 分子识别，并被递呈到 CD4+ T 细胞受体（TCR）继而将 T 细胞活化（见图 1）。在小鼠模型中，I-Aq 限制性 CII 主要抗原决定区 CII263-271已被发现3，并且这个表位与 MHC II 和 T 细胞受体（T cell receptor, TCR）之间的结合也获得了成功鉴定4。因此，作用于 RA 患者的 C

18、D4+ T 细胞的 CII主要抗原决定区的确定显得至关重要。图1. 抗原递呈细胞（APC）与CD4+T细胞之间的相互作用。APC递呈的MHC II分子与之结合的多肽复合物被CD4+ TCR识别，在共刺激分子的作用下将T细胞活化。12HLA-DRB1 共享表位区（Shared epitope, SE）是人们目前发现的与RA最密切相关的遗传因素之一5。然而，这一共享表位区具有种族差异性：在欧洲RA患者中HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401 和HLA-DRB1*0404基因型所占比重较大，而在亚洲RA患者中（在中国、日本、韩国人群尤为显著）约30-40%的患者携带HLA-DRB1*

19、0405等位基因6-8。在CIA模型和HLA-DRB1*0101，HLA-DRB1*0401 或HLA-DRB1*0404等位基因携带者的RA病人中间，自身反应性T细胞能够识别同一条CII260-273肽段3。位于264位点的赖氨酸（K264）能够被羟基进而糖基化。研究证实T细胞识别糖基化的CII多肽在关节炎产生方面起到了非常重要的作用9。Balik等人研究表明在CIA动物模型中，糖基化CII259-273/Aq 复合物有效抑制了关节炎的产生10 。该研究主要针对携带HLA-DRB1*0405 主导基因型的亚洲 RA 患者 ， 旨在确定 CII 特异性 ，HLA-DRB1*0405限制性T细胞

20、表位，该表位的确定将为RA疫苗的研发奠定科学基础。1.2 类风湿关节炎的国内外研究现状1.2.1 类风湿关节炎的遗传因素RA 是一种相对复杂的多因素导致的慢性自身免疫性疾病，环境因素比如高钠摄入、吸烟或某些病菌或病毒感染均可以引起 RA 的发病，而遗传因素占30%-50%11。位于第 6 号染色体短臂上的 21.31 区（6p21.31）的 HLA 复合体目前被认为是与该疾病最为密切相关的遗传因素之一。Stastny 于 1978 年首次证实 HLA-DRB1*0401 基因与 RA 相关 12 ， 1986 年， Nepom 发现了HLA-DRB1*0404 基因也与 RA 存在着一定关联性

21、13。目前研究表明与 RA 相13关的等位基因包括：HLA-DRB1*0101、*0102、*0401、*0404、*0405、*0408、*0409、*0410、*1001、*1402、*1406 和*1409 11，这些等位基因在 HLA-DR分子链位于 70-74 位点的第三超变区共同拥有一个相似的表位：QRRAA-*0101 、*0102 、*0404 、*0405 、*0408 、*0410 、*1402 、*1406 ；QKRAA-*0401 或者 RRRAA-*1001 5。这一共享表位区大大影响了与多肽的结合以及被 CD4+T 细胞的识别。而 HLA-DRB1*0402 (DE

22、RAA) 则被列为保护基因型14。相关研究证实该共享表位区在种族之间存在很大的差异：在欧洲RA 患者中，基因型为 HLA-DRB1*0101、*0401 和*0404 的比重较大8，然而在亚洲 RA 患者中，约 30-40%的患者携带 HLA-DRB1*0405 等位基因，该基因所占比重最大。相关文献报道，HLA-DRB1*0405 基因尤其与韩国，日本和中国的 RA 患者密切相关。而全球大约有 11.9%的正常人群携带 HLA-DRB1*0405等位基因 15。因此，该项目研究的出发点是重点针对 HLA-DRB1*0405 基因型阳性的 RA 患者设计个体化治疗研究方案，其中 CII 特异性

23、，HLA-DRB1*0405限制型 T 细胞表位的鉴定是首要任务。1.2.2 类风湿关节炎的自身抗原及其 T 细胞表位RA认为是由关节内自身抗原引发的，人体内存在多种关节特异性蛋白，例如： CII、蛋白聚糖、HCgp39、瓜氨酸化丝聚蛋白和波形蛋白等等。尽管经过数年的研究，引发RA的自身抗原到目前为止尚未给出一个定论，然而在诸多自身抗原中，CII目前被认为是引发RA的最潜在的自身抗原，因为CII是构成关节透明软骨的主要蛋白，在3%-27%RA患者的血清中可检测到CII的特异性抗体16，而且在最常用到的CIA动物模型中用CII可诱发小鼠产生关节炎。其中CII蛋白的翻译后修饰在诱发炎症过程中起到了

24、至关重要的作用。14RA患者发炎的软骨组织和滑液中含有大量活化的CD4+ T细胞17，并且自身反应性T细胞的数量与患者的病情呈现一定的关联性18。现在研究明确的是在Aq和DR4转基因小鼠模型中，位于CII 264和270位点的两个赖氨酸可羟基化继而糖基化，这一修饰可被T细胞识别，从而诱发CIA或者对自身CII产生免疫耐受19, 20。目前研究最多的HLA-DRB1*0401分子与RA相关的T细胞表位为CII 261-273, 并且二者之间的亲和力以IC50表示为180nM21。另有文献报道在HLA-DRB1*0401和*0101转基因CIA动物模型中自身反应性T细胞能够识别CII蛋白259-2

25、73段表位22，这段表位与Aq相结合。T细胞可以特异性识别这段翻译后修饰表位的现象同样存在于基因型为DR4的RA患者中17，这一发现表明针对表位的特异性治疗可能会给RA患者带来光明。然而种族差异，不同的种族携带不同的 HLA-DRB1 分子，不同的HLA-DRB1 分子结合的 T 细胞表位也会存在一些差异。据相关文献报道，可以结 合 HLA-DRB1*0405 分 子 的 多 肽 包 括 CII 256-271 ：GEPGIAGFKGEQGPKG23、CII 429-442: GGVGPIGPPGERGA、 CII 593-610:SGFQGLPGPPGPPGEGGKP、和CII1064-10

26、81:RGFTGLQGLPGPPGPSGD24，然而只有CII 1064-1081 这条多肽能够刺激67%的携带HLA-DRB1*0405 等位基因的 RA 患者的PBMC 产生IL-2 和IFN-25,说明 CII 1064-1081 是 HLA-DRB1*0405 分子最有可能的 T 细胞表位。基于此项研究，我们根据 CII 的三螺旋结构重新命名多肽 hCII931-949，公司合成并通过一系列多肽竞争结合实验和晶体结构首次从结构和功能上鉴定了 CII 来源的HLA-DRB1*0405 分子限制型的 T 细胞表位。152.实验材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验试剂与耗材hCII93

27、1-949(GHRGFTGLQGLPGPPGPSG);hCII931-945(GHRGFTGLQGLPGPP) 及其被丙氨酸逐一位点替换的多肽; hCII259-273(GIAGFKGEQGPKGEP);hCII259-273_P4E266L(GIAGFKGLQGPKGEP);HA306-318 (PKYVKQNTLKLAT) 以及生物素标记的 hCLIP (Biotin-Ahx-hCLIP:Biotin-Ahx-KPVSKMRMATPLLMQA) 多肽均由 Biomatilk 公司合成，每条多肽的纯度都在 95% 以上。 HLA-DRA*0101, HLA-DRB1*0405-hCLIPmu

28、t 和HLA-DRB1*0405-hCII931-949 序列由德国 Eurofins Genomics 公司合成。 质粒小提, 大提试剂盒和 QIAamp DNA blood Midi Kit 均购自 QIAGEN 公司。10,000X Gelred nucleic acid gel stain 购自 Biotium 公司。Expi293FTM 细胞, Expi293 蛋白表达培养基，Opti-MEM，RPMI 1640 培养基，L-Glutamine, 重组 human IL-2蛋白，羧苄青霉素，青霉素-链霉素，Nu12% Bis-Tris 蛋白分离胶和 IFNgamma human un

29、coated ELISA kit 均购自 Thermo fisher scientific 公司。FectoPROTM 转染试剂购自 Polyplus 公司。组氨酸标签镍柱亲和层析柱，HiLoad16/60 Superdex 200 pg凝胶过滤预装柱, Vivaspin 20 30kDa 蛋白浓缩管,Amersham hyperfilm ECL 化学发光试剂盒和 Ficoll-paqueTM plus 均购自 GEHealthcare 公司。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 标记的山羊抗鼠二抗购自 SouthernBiotech 公司。DELFIA Eu

30、-N1 Streptavidin 购自 Perkin Elmer公司。5ml, 10ml 和 25ml 吸管均购自 Sarstedt 公司。HPLC 级纯水购自山海默恩化学科技有限公司。ELISA Costar 3590 酶标板购自 VWR 公司。16主要仪器冰箱 BCD-215KAV DZHaier冰箱 BCD-573WY-C Ranshen-80超低温冰箱88000 Thermo Fisher Scientific磁力搅拌器 GL-3250C Kylin-Bell Lab Insruments抗体孵育摇床 TSC-8 Qiliv BEI ERYIQIZHI水平摇床 TS-1 Qiliv B

31、EI ERYIQIZHI电泳仪 BG-Power6000 BAYGENE蛋白电泳槽 Mini-protean Tetra Bio-RADDNA 电泳槽 Wide Mini-Sub cell GT Bio-RAD台式离心机 5810R Eppendorf落地式高速离心机 Avanti J-E BECKMAN COULTER金属浴锅 BYQ6044E-216 BIOER TECHNOLOGYCO CTD加热恒温水浴锅 HWS12/HWS28 上海一恒科技公司涡旋振荡器 Mixer V6 ESSENSCIEN手掌离心机 XK-400 珠海黑马医学仪器有限公司超高灵敏度化学发光成像系统 ChemiDo

32、c touch 美国 BiotekG1000 基因扩增仪 TC-96/G/H（b)B 杭州博日科技PH 测量仪 S210 梅特勒-拖利多仪器（上海）有限公司分析天平 220g ME203E METTLER TOLEDO37 CO2 培养箱HF90/HF 240 Thermo Fisher Scientific恒温摇箱 ZWY-211C ZHCHENE制冰机 XB-130-FZ/R134A GRANT烤箱 HH-811-500 上海市跃进医疗器械厂17倒置显微镜 CKX31 Olympus酶标荧光多功能检测仪 Synergy H1 美国 BiotekAKTApure 蛋白纯化仪 GE healt

33、hcare2.2 实验方法2.2.1 E.coli DH5化学感受态细胞的制备取一管商品化的E.coli DH5化学感受态细胞,在制备好的LB 固体培养平板上划线，将平板置于 37孵育一晚以获得单克隆。挑取单克隆到 5ml LB 液体培养基，置于 37摇床培养一晚。第二天，接种 2ml 培养过夜的细菌培养液到200ml 新鲜的 LB 液体培养基，置于 37 度摇床继续培养至 OD600=0.4。将细菌培养液转移至 500ml 离心瓶于 3000g, 4离心 15 分钟。弃掉上清，加入 20ml0.1M CaCl2 重悬，冰浴 30 分钟后于 3000g, 4离心 10 分钟。加入 4ml 含有

34、 15%甘油的 0.1M CaCl2 重悬细胞，分装细胞然后置于-80低温保存。2.2.2 PCEP4-DRA1*0101 及PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut 质粒的构建及鉴定HLA-DRA1*0101 和 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 基因序列送公司合成后，酶切并连接到 PCEP4 表达载体，以热休克的方法转化到 DH5化学感受态细胞中，37培养 1 小时，取菌液涂板。第二天，从 LB 平板中挑取单克隆，37培养过夜后抽提质粒，然后通过双酶切和测序的方法共同鉴定质粒序列的准确性。2.2.3 质粒共转染 ExpiHEK293F 细胞以表达 DRB1*0405-h

35、CLIPmut 蛋白转染前一天准备 ExpiHEK293F 细胞，浓度调整为 1x106/ml 后放置 37二氧化碳细胞培养箱悬浮培养。 24 小时后，在一个含有 Opti-MEM 培养液的试管中加入 FectoPRO 转染试剂，漩涡混匀。在另一个含有 Opti-MEM 培养液的18试管中按一定比例加入 PCEP4-DRA1*0101 及 PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut 质粒并漩涡混匀。然后把两个试管的液体混合并漩涡混匀，室温静置 15 分钟后，把混合物逐滴加入 ExpiHEK293F 细胞培养液中，轻轻混匀。转染后的细胞放到 37二氧化碳细胞培养箱继续培养。2.2.4 DR

36、B1*0405-hCLIPmut 蛋白的纯化转染 5-6 天后，待细胞的存活率为 80%左右终止细胞培养，离心细胞培养液后收取上清，通过 0.45 m 的滤膜过滤，DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白经KTA纯化系统（镍离子亲和层析和尺寸排阻色谱法）纯化。首先用含有 50 mMTris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazole 的平衡液平衡 His-Trap Excel 柱子，然后上样，最后用含有 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazole 的洗脱液洗脱蛋白，洗脱下来的蛋白经过 10KD Amicon Ultra

37、centrifugal filter units浓缩后再经 HiLoad Superdex 200 pg 纯化柱去除蛋白聚集体。纯化后的蛋白可用一抗 Mouse anti-DR 和二抗 anti-mouse-HRP 经下述西方印迹法鉴定。2.2.5 西方印迹法鉴定 DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白（1）常用缓冲液及其配制 30丙烯酰胺溶液丙烯酰胺29 g甲叉丙烯酰胺1 g蒸馏水100 ml搅拌器搅拌溶解，待完全溶解后，过滤，4避光储存备用。 2上样缓冲液(pH6.8)62.5 mM Tris-HCl pH 6.8，2% w/v SDS，10% 甘油，50 mM -巯基乙醇，0.01%

38、 w/v 溴酚兰。取 1 M 的 Tris-HCl (pH 6.8) 0.625 ml，SDS 0.2 g，甘油 1 ml，19-巯基乙醇 0.5 ml，溴酚兰 0.001 g，用水补加至 5 ml。 Tris-甘氨酸电泳缓冲液25 mM Tris 碱，250 mM 甘氨酸，0.1% w/v SDS。可配成 10的储存液，900 ml ddH2O 中溶解 30.2 g Tris 碱和 188 g 甘氨酸，然后加入 100 ml w/v 10% SDS，用 ddH2O 补至 1000 ml。电转移缓冲液25 mmol/L Tris 碱，0.2 mmol/L 甘氨酸，0.037% w/v SDS，

39、20%甲醇(pH 8.5)。可配成 10储液，900 ml ddH2O 中溶解 58 g Tris 碱，29 g 甘氨酸和 3.7 g SDS，ddH2O 补足至 800 ml。用时取 80 mL 10储液用 ddH2O 稀释至 800ml，加入200ml 甲醇，4预冷备用。 10Tris-盐缓冲液(TBS)g Tris 碱，80 g NaCl，加入 800 ml 去离子水，用稀 HCl 调 pH 至 7.6，ddH2O 至总量 1000 ml。使用时，稀释成 1TBS 溶液，加入 0.1%的 Tween-20，即成 TBST 洗涤液。封闭液1TBS 含 0.1% Tween-20 和 5%

40、w/v 脱脂奶粉，搅拌溶解。抗体稀释液1TBS 含 0.1% Tween-20 和 5% w/v 脱脂奶粉，搅拌溶解。（2）免疫印迹操作步骤制备好的样品经比色法测定蛋白浓度，加样，进行 4-12%的 SDS凝胶电泳 1.5-2 小时 (恒流，16 mA/gel)，保证所加样品蛋白总量一致。将 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白用 Bio-Rad 微型电转移系统，于冰上转移至硝酸纤维素膜上(电转移时间和电压因检测蛋白分子量而定)。转膜结束后，将硝酸纤维素膜置于平缓摇动的摇床上，以 20 ml 封闭缓冲液室温下封闭 1 小时或 4封闭过夜。20 5 ml TBST 洗膜 5 次，每次 3 分钟。

41、一抗 Mouse anti-DR L243 单克隆抗体用抗体稀释液 2000 倍稀释，在摇床上室温孵育 1 小时，确保抗体稀释液能完全覆盖膜。 用 25 ml TBST 洗膜 5 次，每次 3 分钟。HRP 标记的羊抗小鼠二抗用抗体稀释液 30000 倍稀释，在摇床上室温孵育 1小时，确保抗体稀释液能完全覆盖膜。 25 ml TBST 振荡洗膜 5 次，每次 3 分钟。膜稍沥干后加入化学发光试剂(125 l/cm2，用前 30 分钟将 A、B 液混合)室温孵育 1 分钟左右，迅速用保鲜膜包好后置于暗盒内与 X 胶片贴在一起进行曝光，曝光时间依发光信号强弱而定，10 秒到 10 分钟左右。X 胶

42、片经显影、定影后晾干，图片扫描后保存。2.2.6 多肽竞争结合实验先将多肽在含有蛋白酶抑制剂的 PBS 中由高浓度到低浓度依次 2 倍稀释，50l/孔由排枪加到 non-binding 的 96 孔板，然后在上述缓冲液中加入适量的DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白和 Biotin-Ahx-hCLIP 多肽，其终浓度分别为 0.1 M和 3 M, 混匀后以 50l/孔逐孔加到同一 96 孔板中，稍稍震荡混匀并离心，室温作用 48 小时。以 L243 抗体提前一天铺 ELISA 板，PBST 清洗后将上述 96孔板中的混合液转移至 ELISA 板中，37孵育 1 小时，PBST 洗四次，加

43、入 2000倍稀释的 Eu-Streptavidin, 37孵育 1 小时洗板，最后加入 Enhancement 溶液，室温作用 5 分钟后读板。212.多肽竞争结合实验图解HLA-DRB1*0405-hCII Pep.复合物结晶及晶体结构解析利用坐滴蒸汽扩散法获得 HLA-DRB1*0405-hCII931-949 蛋白复合物晶体，拿到晶体之后进行 X 射线衍射，收集衍射图谱，通过计算，进一步得到该蛋白复合物的原子结构。2.2.8 从 RA 病人全血中提取基因组 DNAA、试剂准备：加入 4.4 ml ddH2O 到装有 QIAGEN 蛋白酶的小瓶中，待其溶解后分装，置于-20冰箱保存。在

44、AW1 和 AW2 缓冲液中按瓶上说明加入适量的96-100%乙醇，轻轻混匀。B、取 15ml 离心管，每管底部加入 100 l QIAGEN 蛋白酶,然后加入 1ml 全血，22轻轻混匀。C、加入 1.2ml AL 缓冲液，盖上盖子，上下翻转离心管 15 次，然后涡旋震荡 1分钟以充分混匀，然后置于 70水浴 10 分钟。D、加入 1ml 96-100%乙醇到混合液，上下翻转离心管 10 次，然后涡旋震荡以充分混匀。E、将所有混合液轻轻转移到试剂盒提供的 QIAamp Midi 柱式离心管，3000 rpm离心 3 分钟。F、弃掉过滤液，加入 2ml AW1 缓冲液，5000 rpm 离心

45、1 分钟。G、加入 2ml AW2 缓冲液，5000 rpm 离心 15 分钟。H、将 QIAamp Midi 柱置于一个干净的 15 ml 离心管上，加入 200 l ddH2O, 室温静置 5 分钟，5000 rpm 离心 2 分钟。I、提取的基因组 DNA 取 2 l 通过 Nanodrop 测浓度，取适量送北京旌准医疗科技有限公司做HLA-DRB1 基因型鉴定，剩余的DNA样品置于-20冰箱冻存。2.2.9 从 RA 病人全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）A、用 10ml EDTA 抗凝管收集 HLA-DRB1*0405 等位基因阳性的 RA 病人静脉血。B、取 8 ml 血液到

46、50ml 离心管，以等量 PBS 稀释。C、另取 50 ml 离心管，在管底轻轻注入 20ml Ficoll, 将稀释好的血液轻轻铺在Ficoll 上。D、离心机升速和降速设置为 0，20，400g 离心 30 分钟。E、用移液枪轻轻吸出 PBMC 层到一个新的 50 ml 离心管中，加入 30 ml PBS,400g 离心 10 分钟。F、弃上清，2 ml 完全 RPMI 培养基重悬 PBMC, 细胞计数。按 1x106 个细胞/孔铺到 96 孔细胞培养板中，加入 20 g/ml 多肽刺激，同时加入人来源的 IL-223细胞因子，将 96 孔细胞培养板置于 37 二氧化碳细胞培养箱培养 7

47、天。2.2.10 酶联免疫吸附试验（ELISA）A、待 PBMC 培养到第 6 天，用抗人 IFN-gamma 的抗体铺酶标板，100 l/孔，4过夜。B、第二天，PBST 洗板五次，室温封闭 1h。C、PBST 清洗五次，加入标准液与培养第 7 天的细胞培养上清，100 l/孔，4过夜。D、清洗五次，加入生物素标记的抗人 IFN-gamma 抗体，100 l/孔，室温孵育1 小时。E、清洗五次，加入 100 l/孔 Avdin-HRP,室温孵育 30 分钟。F、清洗五次，加入 100 l/孔 1XTMB 溶液，室温孵育 15 分钟。G、待标准品孔出现明显阶梯状蓝色之后加入 50 l 终止液。

48、K、10 分钟之内 450nm 检测 OD 值。L、绘制标准曲线，计算浓度。2.2.11 统计学处理和分析所有都实验都经过三次以上重复和证实。用 Graphpad Prism 5 软件作图，数据用均值 标准差 (x SD)表示。单因素方差分析用 unpaired t-test 方法；双因素方差分析用 Two-way ANOVA 方法。*p 0.05，*p 0.01，*p 0.001表明组间的差异有统计学意义。3.实验结果与分析3.1 表达质粒获得成功构建如图 3A, His-tag 为纯化蛋白用，Fos/Jun 序列的加入能够保证和链形成24二聚体，TEV 酶切位点的加入是为了后续切割蛋白做结

49、晶用。hCLPmut 的存在有助于维持1 和1 之间形成的 Pocket 的空间构象。Thrombin 酶切位点的加入是为了后续其它多肽的替换。图 3B 为 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白的空间结构示意图。(A)(B)图 3. (A) 和链表达序列示意图。(B) HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 及其嵌合的多肽组成的蛋白复合物的空间结构示意图。253.2 西方印迹法鉴定 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白获得成功表达图 4.西方印迹法检测蛋白表达。条带 1：HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白；条带 2：HLA-DRB1*0401-

50、hCLIPmut 蛋白(阳性对照)；3：BSA(阴性对照)。一抗: Mouse Anti-DR L243 单抗，2000 倍稀释，二抗: Anti-mouse IgG-HRP，30000 倍稀释。3.3 对影响蛋白表达量的转染条件进行了优化由于 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白表达需要 和 链共转染ExpiHEK293F 细胞，不同的转染比率会直接影响蛋白的表达量。我们做了几个不同比率的比较，结果如图 5 所示，和链比率在 3:2 时，蛋白的表达量最高，约 8.4mg/L。图 5. 蛋白表达量在不同转染条件下的比较。和链转染比率分别在 1：1；2：3；1：2 和 3：2 条件

51、下 HLA-DRB1*0405-hCLIPmut 蛋白的表达量，*p 0.01。263.4 多肽竞争结合实验证实 HLA-DRB1*0405 蛋白分子可特异性结合 hCII931-949 多肽多肽竞争结合实验用来自流感病毒表面表达的血凝素蛋白（Hemagglutinin）的 HA306-318 多肽作为阳性对照，因为该多肽已经被证实为与 HLA-DRB1*04分子结合力很强的主要抗原表位。如图 6A 所示，HLA-DRB1*0405 和HLA-DRB1*0401 分子与 HA308-316 之间具有相似的结合力， hCII259-273 多肽与 HLA-DRB1*0401 分子具有很强的结合力

52、（ IC50=26 M ）， 与HLA-DRB1*0405 分子却不结合。而图6B 显示, hCII931-949 与HLA-DRB1*0401分子之间的结合力非常弱（IC50=5223 M）, 与 HLA-DRB1*0405 分子却具有很强的结合力（IC50=32 M）。该实验证实 hCII 931-949 可特异性结合HLA-DRB1*0405 分子。如图 6C，hCII259-273 与 hCII931-949 多肽序列的比对显示 P1、P6 和 P9 的残基位点都相同，而 P4 残基位点不同。将 hCII259-273 多肽中 P4 处的残基谷氨酸（Glutamic acid，E）被亮

53、氨酸(Leucine，L)置换后用多肽竞争结合实验（图 6D）检测发现 hCII259-273_P4E266L 与 HLA-DRB1*0401之间的结合力（IC50=187 M）相比 hCII259-273 与 HLA-DRB1*0401 之间的结合力（IC50=26 M）大幅度降低，而 hCII259-273_P4E266L 与 HLA-DRB1*0405分子之间的结合力相比 hCII259-273_P4E266L 与 HLA-DRB1*0405 分子间的结合力（IC50=9 M）大幅度增强。27(A)(B)(C)28(D)图 6. 多肽竞争结合实验及多肽序列比对。 (A) HLA-DRB1

54、*0401 与HLA-DRB1*0405 分子与hCII259-273 多肽的结合，HA306-318 用来做阳性对照。(A) HLA-DRB1*0401 与 HLA-DRB1*0405 分子与 hCII931-949 多肽的结合，HA306-318 用来做阳性对照。(C) hCII259-273 与 hCII931-949 多肽的序列比对。HLA-DRB1*0401和 HLA-DRB1*0405 分 子 与 hCII259-273 和hCII259-273_P4E266L 多肽的结合。3.5 P-2、P1、P4 和 P8 是 hCII931-949 多肽与 HLA-DRB1*0405 分子结

55、合的主要位点为了明确 hCII931-949 多肽与 HLA-DRB1*0405 分子结合的主要位点，我们让公司合成了一系列由丙氨酸（Alanine, A）替换的多肽类似物用来做多肽竞争结合实验。如图 7 所示，丙氨酸在 P-2 精氨酸（Argnine，R）、P1 苯丙氨酸（Phenylalanine，F）、 P4 亮氨酸（Leucine，L）和 P9 甘氨酸（Glycine，G）位点的替换显著降低了与 HLA-DRB1*0405 分子的结合，相反的，脯氨酸29（Proline, P）P8 位点的替换大大增强了 hCII931-949 多肽与 HLA-DRB1*0405分子间的结合，而其它位点

56、的氨基酸替换并未引起显著的改变。该实验说明P-2、P1、 P4、P8 和 P9 是影响 hCII931-949 多肽与 HLA-DRB1*0405 分子结合的主要位点。图 7. 由丙氨酸替换的多肽类似物与 HLA-DRB1*0405 分子的竞争结合实验。丙氨酸在 P-2 、P1 、 P4 和 P9 位点的替换显著降低了 hCII931-949 多肽与HLA-DRB1*0405 分子的结合；在 P8 位点的替换显著增强了 hCII931-949 多肽与 HLA-DRB1*0405 分子的结合；其它位点的替换未引起结合力的改变。数据表示为平均值 SD， , p 0.05;, p 0.01；, p

57、0.001。3.6 HLA-DRB1*0405 分子与 hCII931-949 多肽复合物的晶体结构如图 8 所示，HLA-DRB1*0405 分子与 hCII931-949 多肽复合物的晶体结构揭示了 hCII931-949 多肽 P1、 P4、P6 和 P9 的锚定位点：P1 是位于 935 位点30的苯丙氨酸（Phenylalanine，F），P4 是位于 938 位点的亮氨酸，P6 和 P9 是分别位于 940 和 943 的甘氨酸（Glycine, G）。从 TCR 的角度看，hCII931-949 多肽的侧链位于 936 位点的 P2-苏氨酸（Threonine，T）,位于 939

58、 位点的 P5-谷氨酰胺（Glutamine，Q）和位于 942 位点的脯氨酸（Proline, P）都朝向口袋凹槽的外侧，共同形成了一个与 TCR 结合的极性不带电的界面。图 8. HLA-DRB1*0405 分子与 hCII931-949 多肽复合物的晶体结构。位于 P1、P4、P6 和 P9 的苯丙氨酸、亮氨酸和甘氨酸很好的嵌合到 HLA-DRB1*0405 分子的凹槽内；位于 P2、P5 和 P8 的苏氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸统一朝向凹槽外侧，共同形成了一个与 TCR 作用的界面。3.7 PBMC 体外刺激实验我们从广州珠江医院风湿科收集了 27 例 RA 患者的全血样品（1ml/患者）

59、，如 2.2.8 所述，从 1ml 全血中提取基因组 DNA 后送公司测序以筛选HLA-DRB1*0405 等位基因阳性的 RA 患者。测序结果显示 9 位 RA 患者携带HLA-DRB1*0405 等位基因，其中有四位阳性患者和一位阴性患者愿意无偿为我们提供 10ml 血液样品。我们从采集的抗凝血中提取 PBMC，通过多肽体外31刺激实验发现携带 HLA-DRB1*0405 等位基因的三位患者 RA1、RA2 和 RA3都能被 HA306-318 多肽刺激产生 IFN-gamma。未携带 HLA-DRB1*0405 等位基因型的 RA 患者 RA4 和健康对照（Healthy control

60、，HC）对所加多肽没有任何反应。RA1 和 RA3 患者对 hCII931-949 和 hCII931-945_P8HyP 均没有反应，而RA2 患者的 PBMC 能够被 hCII931-945_P8HyP 多肽刺激产生 IFN-gamma。图 9. PBMC 体外刺激实验。PBMC 被提取出来之后，细胞计数，按 1x106 个细胞/孔铺到 96 孔细胞培养板中，加入 20 g/ml 多肽刺激，同时加入人来源的 IL-2细胞因子，将 96 孔细胞培养板置于 37 二氧化碳细胞培养箱培养。第 7 天，收集上清检测 IFN-gamma 的含量。数据表示为平均值 SD， , p 0.05; , p