成人成骨细胞体外培养

1、成人成骨细胞体外培养关键字：成骨细胞碱性磷酸酶骨钙素胶原摘要：目的：改进成人成骨细胞消化培养方法，以满足在细胞学程度进展骨代谢性疾病研究的需要。方法：取无菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化屡次，以去除血细胞和成纤维细胞；骨片经短期培养后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量纯洁成骨细胞。细胞长至集合后生成黑色结节。分别采用npp底物法、125i标记放射免疫(ria)法和型胶原顺序沉淀抽提、sdspage复原电泳法测定细胞上清中成骨细胞主要特征性分泌物：大量碱性磷酸酶(akp)、骨钙素(n)和型胶原。结果：黑色结节经四环素染色，荧光显微镜下观察为骨结节特征性的金黄色。成骨细胞上清中akp分泌量为(2.760.

2、56)iu/l、n分泌量为(1.8750.549)ng/l，明显高于成纤维细胞(p0.01)。可检测到型胶原而无型胶原。结论：此改进方法可以在短期内得到大量性状稳定成骨细胞，同时防止成纤维细胞混入。关键词：成骨细胞碱性磷酸酶骨钙素胶原成骨细胞特征性表型为分泌骨钙素(n)、大量碱性磷酸酶(akp)和型胶原而无型胶原分泌1。我们采用改进骨组织消化培养方法，将骨片经短期培养后再用胰蛋白酶消化加快骨细胞的释放。经形态学观察及特征性分泌物检测证实获得成骨细胞数量多，并与纤维细胞有明显区别。材料与方法一、液体的配制0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250difdetritihigan)溶解于d-ha

3、nks液，抽滤灭菌。培养液使用de+haf1211混合液(gibbrlgrandislandny)加20%灭活新生牛血清、青霉素100u/l、链霉素100g/l。低血清培养液为5%灭活新生牛血清，其余同培养液。使用252培养瓶(nunlndenark)。二、骨组织片消化取骨科手术中获得的无菌骨碎片彻底去除骨膜及软组织；用无菌hanks液冲洗3次剪碎至体积小于13；hanks液屡次冲洗至骨片发白放入锥形瓶内参加0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍体积)37水浴中消化(30in5)去掉上清。剩余骨片浸泡于培养液中置372培养箱内23d后吸出培液参加0.25%胰蛋白酶37水浴中消化30in上清液经尼龙网

4、过滤后离心10in(1000r/in)去掉上清液沉淀物用培养液打匀接种于252培养瓶内重复3次直至离心后无沉淀物为止。将消化后的骨片浸泡于培养液中23d后重复上述胰蛋白酶消化步骤仍有细胞释放根据所需细胞量可重复数次。接种后培养瓶内培养液较浑浊10h后即有贴壁细胞72h后细胞完全贴壁可冲洗、换液。此后隔日换液。取第二、三代细胞，消化后，以1105/l浓度接种于培养瓶中，每瓶4l5d后换低血清培养液6l，24h后搜集上清液，分装于5个离心管内，-18保存用于检测。三、成骨细胞特征性鉴定以皮肤成纤维细胞作为对照，鉴定实验所得成骨细胞。1.形态学观察:除常规形态学观察外，采用趋骨性荧光素标记细胞培养生

5、成结节。细胞培养瓶内参加四环素使终浓度为50g/l培养箱内培养1h换新颖培养液培养1h，经hanks液冲洗3次乙醇梯度脱水固定lypus-vanx-t显微镜落射荧光观察。2.成骨细胞上清液akp检测:采用磷酸对硝基苯酯二钠盐(p-nitrphenylphsphatedisdiusaltnpp上海丽珠东风公司)比色法2无色p-npp与akp在37水浴中反响生成黄色对硝基苯p-nitrphenl经405n波长比色测得d值换算成国际单位。3.成骨细胞上清液中骨钙素检测:采用bgp放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)检测3。根据放射免疫竞争结合原理，125i标记n和样品所含n与n抗体竞争结合，使用别离

6、剂使结合抗体沉淀，4离心后，计数器测定沉淀物p数，根据标准品曲线得到样品n含量。4.成骨细胞上清液中胶原抽提及检测:采用中性、酸性nal溶液顺序沉淀抽提4，sds垂直板复原电泳法2。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝胶板固定于垂直板电泳槽5。电泳液为0.05tris、0.38甘氨酸、0.01%sds(ph=8.8)；样品液为0.125tris、15%甘油、2尿素、2%sds、0.001%溴酚兰；染色液为0.25%考马斯亮蓝r250、25%异丙醇和10%ha；脱色液为5%异丙醇和8%ha。样品解冻后放55水浴中变性1h参加样品缓冲液50l每个样品点2孔每孔加样20l另加型胶原标准品50a恒

7、定电流电泳1h后每个样品第1孔内参加100l20%巯基乙醇(-eraptethanl，siga)样品缓冲液静置1h后13a恒定电流电泳12h染色液染色1h脱色液脱色24h拍照片。四、统计方法使用statpal软件包对所得数据进展t检验。结果1形态学观察：骨组织消化后所得细胞接种于培养瓶，10h后开场有梭形贴壁细胞；72h后细胞全部贴壁并伸出生长突，可见细胞呈梭形或鳞片状生长细胞外表分泌物较多；1周后细胞开场呈现成骨细胞形态多数呈鳞片形体积较大多伪足胞浆丰富胞核较大偏于一侧有23个核仁6，7一般24周至集合；继续培养可见部分多层生长并有黑色结节生成。经四环素标记荧光显微镜观察为金黄色亮区证实为骨

8、结节。透射电镜下观察培养细胞体积较大长方形或方形，约40胞浆丰富内含大量粗面内质网，呈旺盛分泌相。2成骨细胞上清中akp检测：24h成骨细胞上清中，akp分泌量为(2.760.56)u/l，高于成纤维细胞分泌量(1.960.23)u/l。两者相比，差异有显著性意义(p0.01)。3成骨细胞上清中骨钙素检测：24h成骨细胞上清中，n分泌量为(1.8750.549)ng/l，亦高于成纤维细胞分泌量(1.1900.591)ng/l，差异有显著性意义(p0.01)。4胶原检测：成骨细胞有大量型胶原分泌无型胶原分泌；成纤维细胞型胶原均有分泌。讨论一、成骨细胞体外培养方法的建立早在20世纪60年代pek和

9、birge8开场用胶原酶消化骨片体外培养成骨细胞获得成功；1975年ng等9采用屡次胶原酶消化使培养的成骨细胞得到纯化。1985年rbey和terin等10采用低a2+培养液培养骨片获得成骨细胞经过鉴定比酶消化法得到的细胞更加纯化。本实验改进上述方法先使用比胶原酶更廉价的胰蛋白酶进展屡次消化胰蛋白酶仅能消化骨小梁外表细胞周围的基质，而对于埋藏于骨基质中的大量静止骨细胞无作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨组织中残留的血细胞、成纤维细胞、骨髓细胞及部分成骨细胞和骨细胞，因此弃之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化，无细胞释放，证实骨片中仅含有埋藏于基质中的骨细胞，而无其它细胞。骨片在培养液中浸泡后，静

10、止骨细胞通过骨小管内细胞缝隙连接11感知外界溶液浓度变化特别是钙离子浓度变化10开场活泼起来通过骨细胞性溶骨作用12释放出来在骨片周围形成贴壁细胞但一般要经过2周以上时间且贴壁细胞仅出现于骨片周围10数量有限。在骨细胞释放出来以前再次使用胰蛋白酶可大大加速其释放速度和数量既代替了胶原酶的作用又可防止成纤维细胞的混入。消化细胞接种后，经23周培养可达集合取第2、3代细胞检测，可防止长期培养，反复传代后引起细胞分化和表型的改变。本实验结果显示，此方法简单、实用，并可获得足够数量的成骨细胞。二、成骨细胞与成纤维细胞的鉴别骨组织消化后的上清液中，除成骨细胞外，不可防止的混有骨髓中的血细胞及成纤维细胞。

11、血细胞为悬浮细胞，换液后即可去除。成纤维细胞与成骨细胞来源一样，同为贴壁细胞，且生长极迅速，很快取代成骨细胞。ng和hn9的研究证实，用胶原酶消化6次后，可根本消除成纤维细胞；rbey和terine10的研究说明，胶原酶消化所得细胞均含有成纤维细胞，骨片培养所得成骨细胞可消除成纤维细胞。因此，消化后的成骨细胞主要与成纤维细胞鉴别。成骨细胞为间质来源细胞，具有强大分泌功能骨基质成分几乎都由成骨细胞分泌。因此，在生长旺盛期，骨细胞在相差显微镜下表现为细胞体积较大，呈鳞片状，胞浆丰富，多伪足7。透射电镜下，其胞核较幼稚，胞浆内几乎都被粗面内质网占据，表现出旺盛分泌功能，这是电镜下区别于其它细胞的形态

12、特征13。成纤维细胞分泌才能较差，细胞一般呈梭形，两端具有细长突起，胞体无伪足。四环素与沉积的钙盐有特殊的亲合力，常用来标记体内形成的新骨，在荧光显微镜下，成骨细胞形成的新骨经标记后呈现特征性的金黄色。除以上形态学观察外，还可通过检测骨细胞特征性分泌物鉴别成骨细胞和成纤维细胞。n为成骨细胞特征性分泌物，除牙本质外，至今未在其它组织中发现该物质。n是一类维生素k依赖性、含有羧基谷氨酸的非胶原蛋白，如同在凝血酶构造中的作用一样，羧基谷氨酸与钙离子有较强结合力因此被认为与钙盐沉积和羟基磷灰石形成有关。成骨细胞分泌型胶原而无型胶原分泌，成纤维细胞同时分泌型胶原。大量akp的分泌是成骨细胞另一特征，ak

13、p有不同组织分泌的多种同工酶，检测其骨特异性同工酶，并结合上述两项特征性指标，可作为鉴定成骨细胞的标准；而成纤维细胞仅有少量akp分泌。三、型胶原的鉴别型胶原均属于纤维状胶原。胶原分子由3股多肽链组成，多肽链之间由共价键相连，型胶原由两条1链和一条2链组成，用1()22表示；型胶原由三条1链组成，用1()3表示。ebster和harvey4根据胶原在不同浓度nal溶液中溶解度不同的性质，建立了细胞培养液中抽提胶原的方法；laeli14建立了胶原sds复原电泳方法。胶原经55水浴变性后，胶原纤维分解为分子，再经巯基乙醇复原，多肽链之间共价键被翻开，样品缓冲液中的sds是强阴离子集团，与胶原分子单链形成带负电荷的复合物，这种复合物使蛋白质丧失了原有电荷状态和构象差异，各链在电场中挪动速率仅与分子量有关，在(15200)103道尔顿之间，迁移率与分子量的对数呈线性关系