常用蛋白还原剂变性剂

1、常用蛋白复原剂及变性剂常用蛋白复原剂及变性剂常用蛋白复原剂及变性剂常用蛋白复原剂1DTT中文名称为二硫苏糖醇（Dithiothreitol，简称为DTT），是苏糖醇的C-1及C-4位羟基置换成巯基的化合物。在生化反响顶用做复原剂，保护蛋白质或酶中的巯基不致氧化而失活。也常用于复原蛋白质分子中的二硫键等。DTT是一种小分子有机复原剂，化学式为C4H10O2S2。其复原状态下为线性分子，被氧化后变成包含二硫键的六元环状构造。二硫苏糖醇的名字衍生自苏糖（一种四碳单糖）DTT的异构体为二硫赤糖醇（DTE），即DTT的C3-差向异构体。DTT也经常被用于蛋白质中二硫键的复原，可用于阻截蛋白质中的半胱氨酸

2、之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但DTT经常没法复原包埋于蛋白质构造内部（溶剂不可及）的二硫键，这种二硫键的复原经常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M盐酸胍、8M尿素或1%SDS）。反之，依据DTT存在状况下，二硫键复原速度的不同样，。能够判断其包埋程度的深浅。-巯基乙醇英文名称：-Mercaptoethanol，化学式：HOCH2CH2SH，分子量：78.13，是一种拥有特别臭味的无色透明液体，易燃、易溶于水和醇、醚等多种有机溶剂。-巯基乙醇(又称为2-巯基乙醇、1-硫代乙二醇、2-羟基乙硫醇、-硫醇代乙醇）是一种有机化合物，其化学式为HOCH2CH2SH，英文通用缩写

3、为ME或-ME。它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能团，为挥发性液体，拥有较激烈的刺激性气味。-ME平常用于二硫键的复原，能够作为生物学实验中的抗氧化剂。它被广泛使用的原由是它的羟基使它能够溶解于水中，并且降低它的挥发性。因为拥有较低的蒸汽压，它的难闻的状况比起恶臭的硫醇要好得多。2-巯基乙醇能够翻开蛋白质中存在的二硫键：cysS-Scys+2HOCH2CH2SH2cysSH+HOCH2CH2S-SCH2CH2OH，二硫键被翻开后能够使蛋白质的四级或三级构造被损坏。因为2-巯基乙醇能够翻开蛋白质的构造，它经常被用于蛋白质分析。而2-巯基乙醇也经常被用于保

4、护蛋白质中自由的半胱氨酸巯基之间不会错误形成二硫键。作为复原剂，2-巯基乙醇经常能够与二硫苏糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）交换使用。2-巯基乙醇是少量几种被发现能够延伸小鼠寿命的化合物。在微克量级水平上，2-巯基乙醇被察看到对实验鼠的生命拥有多种可能的正面效应。3.TCEP?化学名称：三(2-羧乙基)膦；英文名称：Tris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）；分子量：250.19。无色透明液体，不溶于脂肪烃，微溶于水，溶于醇、酮、酯、醚、苯、甲苯、二甲苯等，能与氯仿及四氯化碳混溶，与醋酸纤维素、硝酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、乙基纤维素、聚氯乙烯、

5、酚醛树脂、聚丙烯酸酯等高聚物相容性好。TCEP是一种特别有效的硫醇类复原剂，宽泛用作蛋白质化学及蛋白质组学研究中二硫键的定量复原剂。该试剂在水溶液中的坚固性和溶解性都很好。在酸性、碱性溶液中的坚固性也不错。与其余类其余硫醇类复原剂如DTT比较，TCEP不只是一种高效的二硫键复原剂，并且在某些巯基的交联反响中不需要除去。因此在蛋白质化学及蛋白质组学研究经常优先选择TCEP。TCEP在很宽的PH值范围内都能够选择性定量地复原哪怕水溶性很差的烷基类二硫化合物。平常室温下反响不到5分钟就能够达成。TCEP没有难闻的气味，并且在空气中不怕氧化。增补：DTT，beta-巯基乙醇，TCEP等是巯基类复原剂。

6、复原剂能够保护蛋白质上自由的巯基不被氧化，进而防范蛋白质的齐集或变性。在结晶实验中，一般使用的复原剂工作浓度是110mM。beta-巯基乙醇是上述三种复原剂中复原能力最差的一个，因为它自己只有一个巯基。它的见效一般只好保持23天。因此，在实验中要每隔23天补加一次beta-巯基乙醇来维持它的作用。因为beta-巯基乙醇是挥发性的，因此，能够在池液中加入beta-巯基乙醇，利用它的挥发扩散到液滴中去。二硫苏糖醇DTT有两个巯基基团，其作用能保持37天。DTT的挥发性不像beta-巯基乙醇那么强，因此使用时应当直接加入到悬滴中去。DTT还能够够经过微透析的方法加入。TCEP的复原能力比使结晶用的缓

7、冲液酸化。与beta-巯基乙醇和DTT近似，DTTTCEP都强，它的作用能够保持23周。TCEP需要直接加入到悬滴中，因此能够考虑微透能析法。beta-巯基乙醇，DTT，和TECP的作用系统可能不同样。像其余增添剂同样，假如你发现一类物质对样品的坚固性和结晶有益，则能够去优选这一类物质中最合适你的样品的一种。我们建议是，最好这三种复原剂都试一试试看，去发现最合适的。复原剂能够与金属离子联合，金属离子其被复原，而复原剂的作用被控制。这就使得用重金属原子作同晶置换法碰到了麻烦。能够使用EDTA来防范复原剂被金属离子控制。但是，假如金属离子是你的样品蛋白保持活性所必然的，就要当心使用EDTA了。碱性

8、条件下，beta-巯基乙醇和TECP更坚固，见效要好于DTT。酸性条件下，TCEP的坚固性也要好过DTT。DTT能够使Ni被复原，因此在用Ni柱纯化His标签的蛋白时要防范使用DTT，而应该考虑beta-巯基乙醇和TECP。半胱氨酸也是一种复原剂。在结晶实验中，半胱氨酸限制性很显然，那是因为它简单形成六角形的晶体。可是，半胱氨酸是一种有效的增添剂，能带来显然的见效，可是需要铭刻它的限制性。假如预期到蛋白会被氧化，从制备样品开始就要加入复原剂，并且在整个流程中要不停补加保证其见效。在悬滴法中，能够在池液里加入复原剂，利用复原剂的挥发扩散，保证悬滴中复原性的环境。在确立复原剂和样品比率时，需要考虑

9、样品上自由巯基的数量和样品浓度。自由巯基数目越多，样品浓度越高，复原剂的用量就越大。含砷化合物与复原剂不可以够共用。二甲胂和二甲胂酸钠是结晶中常使用的含砷化合物，它们不可以够与复原剂共同使用。其余不可以够与复原剂一同使用的物质还包含：硝酸铵，过氧化氢，高氯酸钾，硝酸钠。在使用某种物质以前，应当先查阅MaterialSafetyDataSheet(MSDS)。4.SDSSDS是一种阴离子去污剂，它能损坏蛋白质分子之间以及其余物质分子之间的非共价键。在强复原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被翻开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分联合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合

10、物，复合物所带的负电荷大大超出了蛋白质分子原有的电荷量，这就除去了不同样蛋白质分子之间原有的电荷差别，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。SDS不只好够分别判断蛋白质，并且能够依据迁徙率大小测定蛋白质亚基的分子量。DTT和巯基乙醇比较，作用相像，但低好多。并且DTT比巯基乙醇的浓度低DTT的刺激性气味要小好多，毒性也比巯基乙醇7倍时，二者见效周边。但DTT价钱略高一些。DTT有两个巯基公司，巯基乙醇只有一个巯基公司。常用蛋白变性剂盐酸胍和尿素尿素和盐酸胍在高浓度(48mol/L)水溶液时能断裂氢键，进而使蛋白质发生不同样程度的变性。同事，还能够够经过增大疏水基酸性残基在水相中的溶

11、解度，降低疏水互相作用。在室温下46mol/L尿素和34mol/L盐酸胍，可使球状蛋白质从天然状态转变至变性状态的中点，平常增添变性剂浓度可提升变性程度，平常8mol/L尿素的变性能力强。一些球状蛋白质，甚至在8mol/L尿素溶液中也不可以够完满变性，可是在8mol/L盐酸胍溶液中，他们一般以无规则卷曲(完满变性)构象状态存在。尿素和盐酸胍惹起的变性包含两种系统：1、变性蛋白质能与尿素和盐酸胍优先联合，形成变性蛋白质-变性剂复合物，当复合物被除去，进而惹起ND反响均衡向右挪动。随着变性剂浓度的着呢国家，天然状态的蛋白质不停转变成复合物，最后致使蛋白质完满变性。可是，因为变性剂与变性蛋白的联合是特别弱的。因此，只有高浓度的变性剂才能惹起蛋白质完满变性；2、尿素与盐酸胍对谁说氨基酸残基的增溶作用。因为尿素和盐酸胍都拥有形成氢键的能力，当他们在高浓度时，能够损坏水的氢键构造，结果尿素和盐酸胍就成为非极性