“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案

1、产淀粉酶（-淀粉酶）细菌菌株精选一、实验目的：掌握从环境中收集样品并从中分别纯化某种微生物的完满操作步骤。稳固从前所学的微生物学实验技术。学习淀粉酶活性的测定方法。二、实验原理:1.淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌,宽泛散布于自然界，特别是在含有淀粉类物质的土壤等样品中.2.从自然界精选菌种的详细做法，大概能够分红以下四个步骤：采样、富集培养、初步精选、分别纯化和性能测定。采样:即收集含菌种的样品收集含菌样品前应检查研究一下自己打算精选的微生物在哪些地方散布最多，尔后才可着手做各项详细工作。在土壤中几乎各样微生物都能够找到,所以土壤可说是微生物的大本营。好似厨房土壤、面粉加工厂和菜

2、园土壤中淀粉的分解菌很多。b)富集培养:富集培养就是在所收集的土壤等含菌样品中加入某些物质,并创办一些有利于待分别微生物生长的其余条件，使能分解利用这类物质的微生物大量生殖,从而便于我们此后中分别到这类微生物。初步精选：（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，经过培养基的特别成分,来精选出目的菌种，进而进行培养.（鉴识培养基）初筛利用鉴识培养基，经过增添一些特其余试剂或成分来鉴识出目的菌种，进而精选出来并对其进行培养。分别纯化：三、经过上述的精选只能说我们要分其余目的菌种已经存在,但还要把夹杂在其中的杂菌除掉，进而获得纯种的菌落。纯种分其余方法好多，主要有:平板划线分别法、稀释分别法、

3、单孢子或单细胞分别法、菌丝尖端切割法等。e)性能测定：分别纯化获得的菌种此后，所分得的菌种可否拥有实验所要求的性能,还必定要进行性能测定后才能决定弃取。实验资料:培养基配制：培养基按以下比率配制后，加蒸馏水调至100%；富集培养基：可溶性淀粉1、蛋白胨1%、葡萄糖0。5、NaCl0.5、牛肉膏0.5、pH7。0；分别培养基：玉米粉2、黄豆饼粉1。5、琼脂粉0.8%、CaCl0。02%、MgSO40.02%、NaCl0。25、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2、硫酸铵0.075%(溶解后加入）、Na2HPO40。2%、pH7.0。主要试剂和溶液的配制：2淀粉溶液：正确称取淀粉2g溶于100ml

4、0。1mol/LpH5。6的柠檬酸缓冲液中。0。1mol/L的柠檬酸缓冲液、pH=1。0的盐酸1%的3，5-二硝基水杨酸:精准称取1g3，5二硝基水杨酸,溶于20ml2mol/L氢氧化钠溶液中，加入蒸馏水50ml，再加入四水酒石酸钾钠蒸馏水定容100ml，盖紧瓶塞，间隔CO2。30g，待溶解后用0.1葡萄糖溶液：正确称取80烘干至恒重的无水葡萄糖0.1g，去离子水溶解后定容至100ml。0.1%标准麦芽糖溶液：称取麦芽糖100mg，用蒸馏水溶解并定容至100ml。四、实验方法：采样与稀释：a)从实验楼前的小树林中收集土样，称取5g土样，放入装有45mL无菌水的三角瓶中，震荡20min后静置5m

5、in。尔后对其进行浓度梯度稀释到10-6,分别稀释到104、105、10-6浓度下。富集培养：从上述土壤稀释液中各取1mL注入无菌培养皿中，尔后倒入灭菌并融化冷却至50左右的富集培养基，小心摇动冷凝后，倒置于37保温箱中培养24小时。初步精选：培养24小时后,取出平板,向平板中注入1滴革兰氏碘液，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有无色透明圈,说明该菌能分解淀粉，即该菌株能够产生淀粉酶。经过影印法或点种法将能够产生淀粉酶的菌株接种到相同的无菌培养中，重复操作进行培养.4.分别纯化：a)初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分别。将划线分别后的培养皿放入37培养箱中培养

6、24小时。5.性能测定：a)标准曲线的制作：i.取7支20ml起初干净灭菌干燥的试管,编号,加入试剂见表1。每个浓度做3个平行样本。摇匀，至开水浴中煮沸5min.取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml，以1号管作为空白调零点，在520nm的波长下比色测定吸光度值，并成立经过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。表1淀粉酶标准曲线的制作试管号麦芽糖标准液麦芽糖含量蒸馏水3,5二硝基水（ml)（mg）(ml）杨酸（ml）1002.02。020.20.21.82。030。60.61。42.041.01。01.02。051。41。40。62。061.81.80。22。072。02.002。0b)i.酶活力测定：第一制备待测粗酶液：取培养好菌株的分别培养基进行4000rpm离心20min，并收集上清液即为待测粗酶液.取20ml起初干净灭菌干燥的具塞刻度试管，编号。并按步骤操作：取粗酶液1。0ml加2%的可溶性淀粉1ml，蒸馏水3ml，于60水浴中预热5min加0.1ml/l柠檬酸缓冲液（pH6.0）1ml于60水浴中保温30min加3,5-二硝基水杨酸1.5ml,开水浴中煮沸5min，快速冷却，加蒸馏水定容至20ml。iii.空白比较：取粗酶液1.0ml，加入pH1。0的盐酸钝化