cn.6a用于水产养殖的可口服给药免疫刺激产品1

1、(19)民国家知局(10)(43)号 CN 日 A(21)(74)专机构永新专利商(22)9/5039/39(19)民国家知局(10)(43)号 CN 日 A(21)(74)专机构永新专利商(22)9/5039/3938/19WO2010/041096EN(71)权利要求书 2 说明书 14附图 6如在宿主微生物中过度表达的肿瘤坏死因子(TNF)CN102209530权利要求书CN1022095301/2如权利要求 2 所述的征在于所述微囊化的重组细胞因子是肿瘤坏死因子 (TNF)。如权利要求 2 所权利要求书CN1022095301/2如权利要求 2 所述的征在于所述微囊化的重组细胞因子是肿

2、瘤坏死因子 (TNF)。如权利要求 2 所述所述微囊化的重组细胞因子在宿主微如权利要求 4 所述的免疫刺激产品，其特征在于所述酵母是巴斯德毕赤酵母toris)6. 如权利要求 1-5 如权利要求 7 所述的免疫刺中所述多细胞生物是卤虫 (Artemia sp.) 或轮形动物 (phylum Rotifera)。述 cDNA，酒酵母 13.如权利要求 12 所述的方法，其特征在于所述肠保护聚合物选自 14.如权利要求 1-9 中任一项所述的可口服给药的免疫刺激产品用于在水产养殖中免疫权利要求书CN1022095302/2如权利要求 14 所述中所述细胞因子源自所要免疫刺激的权利要求书CN1022

3、095302/2如权利要求 14 所述中所述细胞因子源自所要免疫刺激的21.1-9。3说明书CN1022095301/14用于水产养殖的可口服给药的免疫刺激产水产养殖似乎是满足渔业 (extractive fishing) 所100万吨的产量提高到 2004年的 5940万吨。该产量水平的价值为 703 。全世界产量的 69.6产于中国，21.9产于亚洲其它地区说明书CN1022095301/14用于水产养殖的可口服给药的免疫刺激产水产养殖似乎是满足渔业 (extractive fishing) 所100万吨的产量提高到 2004年的 5940万吨。该产量水平的价值为 703 。全世界产量的

4、69.6产于中国，21.9产于亚洲其它地区和太平洋地区，35产于西欧地区，并0.4产于中东环境方2004 年来自海水养殖( 咸水水产养殖) 的水产产量为 3020 产量的 50.9。淡水水产养殖提供 2580 万吨(43.4 )，而其余 340 5.7 ) 来自半咸(brackish) 环境的产量。所有数据均来自于 Pr e of World Aquaculture(FAO如 seabream大菱鲆和贻贝。2002 年的产1810002002532075FAO。严重影响。疾病在很多情况下导致高产量损失的原因。水产损失还导致食物供应减少、收入和就业损失以及各种相关的社会。影响上述物种的最常见疾病

5、及其病原 (causal agent)(菌美人鱼亚种 (Photobacteriumdamselaesubsp.damselae，Vibriospp.)、巴斯德菌病 ( 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种 (Photobacteriumdamselae subp.piscicida)(photobacteriosis)( 美人鱼发光杆菌巴斯德菌亚种 (Photobacteriumdamselae subp.pasteurella)(flexibacteriosis)(maritimum)、分 枝 杆 菌 病 (myxobacteriosis)(maritimus)(Aeromonas salmonicid

6、a)链球菌 (Streptococcusparauberis)、冬 季疾病综合症 ( 病鳝假单胞菌 viral encephaloretinopathy)(Iridoviridae)性胰腺坏死 (性造血组织坏死 (IHNV)毒性性败血症 (VHS)。所有数据均来自 Cultured AquaticSpecies Programme(FAO)0005 原(diseaseagent)4明CN1022095302/14接，QuenVigneulle19972004)Maurice1313/16明CN1022095302/14接，QuenVigneulle19972004)Maurice1313/16

7、Sakai1999(1CuestCuest 和ntd19Roberd1993)(mediate effectors phases)5说明书CN1022095303/14a)IFN 和IFN 的 I 型干扰素 (IFN IL-1IL-1IL-1 受体拮抗剂和 IL-18 的细胞介素 (IL-以及包括 TNFTNF说明书CN1022095303/14a)IFN 和IFN 的 I 型干扰素 (IFN IL-1IL-1IL-1 受体拮抗剂和 IL-18 的细胞介素 (IL-以及包括 TNFTNFLt 和 Fas 配体的肿瘤坏死因子 (TNF) 以及(IFN)(TGF)3GoldfelTsai1996S

8、teinshamLee1991)Sanders1995)。Lotshecone(Watts 等人，1997)。TNF 表达为 26kDa 的膜结合前体，其被解聚素金属蛋白酶 已对数种哺乳动物的 金头鲷的UTACEThr-Leu(Garca-CastilloUS5871751(Renibacteriumsalmoninarum)6说明书CN1022095304/14WO 03/020040A1 的大肠杆菌 (E.coli)、作为多细胞生物的卤虫无节幼体 (Artemianauplii)。根据 的ES 2189608A1 公开了用于生产重组金头鲷(Sparus说明书CN1022095304/14W

9、O 03/020040A1 的大肠杆菌 (E.coli)、作为多细胞生物的卤虫无节幼体 (Artemianauplii)。根据 的ES 2189608A1 公开了用于生产重组金头鲷(Sparus aurata L.)IL-10028 (TNF)即肿瘤坏死因子 (TNF)。因此在提供免疫刺激产品时不会在动物中引入外源物质7说明书CN1022095305/140032 ( 特别是TNF) 成功实现微囊化的主要技术是通过喷雾干燥说明书CN1022095305/140032 ( 特别是TNF) 成功实现微囊化的主要技术是通过喷雾干燥进行雾在通过喷雾干燥进pHLS本发明的另一优点体现在表达 TNF8说明

10、书CN1022095306/1412sbTNFBamHI段。下划线标6 个子和组氨酸。加重标记用于在巴斯德毕赤酵ATGEcoRI说明书CN1022095306/1412sbTNFBamHI段。下划线标6 个子和组氨酸。加重标记用于在巴斯德毕赤酵ATGEcoRIBamHI 6 个ATGEcoRIBamHI段。下划线标6 个子和组氨酸。加重标记用于在巴斯德毕赤酵ATGEcoRIBamHI图6SDSmAbAB)2B)DTAFsbTNFpET15b使用LPS刺激的头肾 cDNA作为PCR中的模板，以使用引物 FE4RE5(1)增 sbTNF。这两个引物都包含 BamHI 限制位点，用于随后在质粒 pE

11、T15b(Novagen) 同位点中克隆 PCR 产物。在包含 cDNA 模板、每种 dNTP 各 50M0.2mM 引物、MgCl21X缓冲PLUSEco Taq PLUS DNA聚合Ecogen)的样品中进行扩增。在6045秒和723025及随72101PCR Purification Kit(Qiagen纯化PCR产物，并在室温下使用 T4DNA连接(NewEngland BioLabsInc片段(insert) 质粒 3 1 的比例与质粒pGEM-Easy(Promega) 连接(ligate)16 用连接混合物转化大肠杆菌DH5 感受布在包含氨苄西林和X-Gal(Sigma) 的LB

12、 37选择数个所得白iniprepKit(Qiagen 9说明书CN1022095307/14pVP81 的 sbTNF pET 15b 线性化。在(Pronadisa) 凝胶中电QIAquick 琼脂(agarose low Extraction Kit(Qiagen纯片段和线性在室温下使用 T4DNA 连接酶(New EnglandioLabsInc.连接 16 小时。使用连接混合物转化说明书CN1022095307/14pVP81 的 sbTNF pET 15b 线性化。在(Pronadisa) 凝胶中电QIAquick 琼脂(agarose low Extraction Kit(Qia

13、gen纯片段和线性在室温下使用 T4DNA 连接酶(New EnglandioLabsInc.连接 16 小时。使用连接混合物转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，并涂布在包含氨苄西林LB 平板上。将平板在 37离数BamHI 片段的方向。使用 rism 合物涂布在包含氨苄西林的 LB 平板上。将数个所得菌落在 LB- 氨苄西林培养基中培养夜。将培养物稀释到新鲜 LB- 37下培养0825GApplichem0.1ml (14000rpm) 来检查全细胞提取物 SDS 上样缓冲液中煮沸以溶解细胞团块(cell pellet)，以供SDS分析和使用抗多组氨酸mAb(Sigma) 的蛋His6- 22

14、下使用 QIAprep His6-Arism (Universityof用于转化的酿酒酵母菌株为EGY48(Invitrogen)。为用于转化的 EGY48，培养基 (2蛋白1酵母提2葡萄糖 ) 0.5100ml养物的细胞在 4下以 2500rpm 离心 5 分钟。在用无菌水新悬浮于1XLiAc-TE(0.1M10mMTrispH7.510l 0.3g/l 的DNA50l细胞(waste) 的步骤后将细胞EDTApH8.0)载体( 预先煮DNA) (mix)1XLiAc-TE-PEG(LiAc-TEPEG40说明书CN1022095308/14MMSS+SDC-Trp(20.170.251MS

15、DC-Trp30葡萄糖补充剂30mg/l50mg/200mg/l150mg/His6-sbTNFYPDMM+SDC-Trp(2葡萄糖说明书CN1022095308/14MMSS+SDC-Trp(20.170.251MSDC-Trp30葡萄糖补充剂30mg/l50mg/200mg/l150mg/His6-sbTNFYPDMM+SDC-Trp(2葡萄糖0.17酵母氮源0.25硫酸铵和 SDC-Trp 的基本培养基 ) 中培养数小时。为Branson 超声波仪 150 中以 1030 秒的脉冲超声或者将其在珠磨式组织研磨器 (bead beater) 中以 8 个 1 分钟的脉冲用玻璃珠破His6-

16、sbTNFSDSmAb(Sigma)3sbTNFHis6-sbTNFpET15bPCRTNF-ECOPPTNF-ECOR1的His6-的片 EcoRI 限制在质粒 pPICZA(Invitrogen) 的相同位点中克隆 PCR 产物。在包含 5ng 各50m0.2mM1X High Speec1X 缓冲液PLUS 和环反应，包括9551 95 30 秒、55 45 秒和72 2 分钟30 个循以及随后 72 10 分钟的 1 个循环。通过在包含 0.5g/ml 溴乙啶的 0.8琼脂糖化。在 37下使用 的EcoRI(Fermentas) 消化纯化片段和 200ng p424-GPD随后22下使

17、用 的 T4DNA 连接酶 (Fermentas) 进行连接。将连接反应物转入大肠杆TOP10F感受态并在含 25g/ml 博莱霉素 (zeocin)(Invitrogen) 的低盐 LB PCR 鉴定重组体。使用 的所得质粒 pPICZA并通过用 iniprep 纯化包含His6-消化检片段的 XhoI 消化检测插入片段的方向。还使用 rism 分析(SACEUniversityo ) 对质进行外序。在重组质粒中，sbTNF 的起始表达的酵母共有序列 codon)ATG 位于用于在酵母中进图 3) 中(Romanos 等人1992。此共有序TNF-ECOPPHis6-的质粒pPICZA 线性

18、化巴斯德毕赤酵母组DNA中的重到 10l 无菌水中。用于斯德毕赤酵母菌株为 X-33。为用于电穿孔的 33 1.5 的 100ml 培养物的细胞在 4下以 1500g 离心 5 分钟。在用无菌洗的 2 细胞重新悬浮于 1M 山梨所述进并最后重新悬浮于 说明书CN1022095309/14穿孔管(electroporation cuvetteBioRad) 中。温育 5 分钟将细胞在 MicroPulser电穿孔仪(BioRad)中在25G1.5kV400的条件下施以脉随即向管中添加1ml(Invitrogen)YPDS说明书CN1022095309/14穿孔管(electroporation

19、cuvetteBioRad) 中。温育 5 分钟将细胞在 MicroPulser电穿孔仪(BioRad)中在25G1.5kV400的条件下施以脉随即向管中添加1ml(Invitrogen)YPDS30PIC5PIC3PCR2XasterMix(Fermentas)分析数个转化体是否存片段并测His6-sbTNFDNAPurification组DNAEcoTaqDNA(Ecogen)His6-sbTNFrism (SACE，Universityof30250rpmHis6-sbTNF25ml63000g50.5甲醇的200mlOD600 1240.5Branson1501030研磨器中以 8 个

20、 1 分钟的脉冲用玻璃珠破碎。在处理离心收集细胞剩余并通SDS 上样缓冲液中煮沸来对上清液进mAb(Sigma)His6-检测，以供 SDS分析和使用抗将sbTNFpET15b 中 1EcoTaqPLUSDNA(Ecogen)SmartQIAquickGelExtractionKit(Qiagen)PCR3710(Fermentas)PCRPurificationKitDNAQIApreprism (SACE，University of His6-His6-His6-pPICZArism SACE，Universityof说明书CN10220953010/14进序。与实施例 3 一样，sbTN

21、F 的起子 ATG 位于用于在酵母中进表达的酵母共有AAAAATGTCT( 图 4) 中(Romanos 1992。此共有序列包含在引物TNF-ECOPP 说明书CN10220953010/14进序。与实施例 3 一样，sbTNF 的起子 ATG 位于用于在酵母中进表达的酵母共有AAAAATGTCT( 图 4) 中(Romanos 1992。此共有序列包含在引物TNF-ECOPP PLUS DNA聚合扩增包含 His6-的以使用 rism 3130(SACE，Universityof0080 使用得自肝的大菱鲆 cDNA 作为 PCR 中的模板，以使用引物 TNFRO-BAMFTNFRO-BA

22、MR( 图 1) 扩增 sbTNF。这两个引物都包含 BamHI 限制位点，用于随后在质粒pET15b(Novagen) 的相同位点中PCR 产物在包cDNA 模板、每种dNTP 各50M1X缓冲液PLUS 和EcoTaqPLUS DNA聚合酶(Ecogen的样品行扩SmartCycler(Cepheid) 中进行循 95 5 分钟的 1 个循环，95 55 45 秒和 72 90 秒的 30 以及随后 72 10 分钟的一个循环。在 0.8琼脂PCR 产物。在 37下使用 BamHI 将纯化片段pET15b 消化 2 下使用 T4DNA连接酶(Fermetas此前使用PCR Purifica

23、tion Kit 纯化的DNA接过夜。使用连接混合物转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞并涂布在包含氨苄西林的 LB 平上。将平板在 37下温育 2X asterMix(Fermentas) 和引T7F 和T7RPCR 鉴定重组体。分离数个所得菌落的质粒，用 BamHI 消化检片段PvuII 消化检测片段的方向。使用 rism 分析仪 (CIB，CSIC) 对所选质His6-His6-克隆到pPICZArism分析仪(SACEUniversityof)进序。与实施例 3 一样，sbTNF 的起子 ATG 位于用于在酵母中进行外表达的酵母共有AAAAATGTCT( 图 5) 中(Romanos 19

24、92。此共有序列包含在引物TNF-ECOPP0087 3PmeI(Fermentas)PLUS DNA聚合扩增包含 His6-的rism 3130(SACE，Universityof说明书CN10220953011/14 Ni说明书CN10220953011/14 Ni His6-Sigma通过用12.5丙烯酰胺/ 双丙烯酰胺的SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) 分析带有His6-的样品。使用 0.1考coomassie) 将凝胶染色 30 分钟，并区His6-21kDa0094 为了通过免疫印迹法检测Tris-HCl150mM 甘氨酸 (glicine20甲醇100V下将凝胶向硝素 0.

25、1n 20)将所述膜温育过夜以阻断蛋白。使用所述膜，然后将其与TTBS+5BSA+11000抗多组氨mAb(Sigma一起温2小时。随后再次使TTBS所述膜后使用ECL(Amersham ) 染色显示出对应His6-21kDa6)高于 30。随后将生长的培养物接种到含有 MMG( 含甘油的基本培养基) 的生反应器系统中。培养条件为 30pH5.00(通过添加进行控制)，在 500-下搅以及搅拌下 30的氧过V2 测量参数。以分批方式进行发酵直培养物达到为 50-80。此后以分批进料方式进行发酵始供 10 小时为 260-280 的培养物 )。最后供给甲醇，持续40 小时，380-420时结束培

26、在发酵达到预期的生物量和重组 His6-说明书CN10220953012/14Kollicoat MAE 100P(BASF0101 随后通过喷雾干燥器(Buchi)通过免疫印迹法分析重组酵母的最终微囊以确定没有细胞存活并且存在 His6- 0104 将卤虫无节幼体在装有 500ml 无菌全浓度 (full-strength) 海水的烧瓶中孵化 ( 去被膜卵 ) 过夜，通过与鱼池气泵相连的送风管曝气，并在往复振荡的水浴中保持在 28。孵化后 24 小时说明书CN10220953012/14Kollicoat MAE 100P(BASF0101 随后通过喷雾干燥器(Buchi)通过免疫印迹法分析重组酵母的最终微囊以确定没有细胞存活并且存在 His6- 0104 将卤虫无节幼体在装有 500ml 无菌全浓度 (full-strength) 海水的烧瓶中孵化 ( 去被膜卵 ) 过夜，通过与鱼池气泵相连的送风管曝气，并在往复振荡的水浴中保持在 28。孵化后 24 小时将无节幼体收集到富集系统中。此系统由装有 100ml