Ecoli原核表达的实验原理材料实验方法

1、Ecoli 原核表达的实验原理/材料/实验方法摘要：E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入 E .coli 菌株以后，通过温度的控制，诱 导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行 SDS以检测表达蛋白质一、原理1、E .coli表达系统E .coli是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli菌株以后，通过温度的控制， 诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检测表达蛋白质。2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成 两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代 -

2、B-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而 定。二、材料、诱导表达材料(1 )LB (LuriaBerta ni)培养基酵母膏(Yeast extract)5g 蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g 琼脂 (Agar)1-2%蒸馏水 (Distilled water)1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌(2 )IPTG贮备液：2 g IPTG溶于10 ml蒸馏水中，0 .22 pm滤膜过滤除菌，分装成 1 ml /份，-20 C 保存。(3 )lx凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris

3、-CI (pH 6 .8 )50 mmol / L DTT% SDS (电泳级)0.1 % 溴酚蓝10 % 甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ) 酶溶法裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI (pH 8 .0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI50 mmol / L苯甲基磺酰氟(PMSF )。(3)10 mg / ml 溶菌酶。(4)脱氧胆酸。(5)1 mg / ml DNase I。2 ) 超声破碎法(1 )TE 缓冲液。(2 )2xSDS 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI (pH 8 .0 )100 mmo

4、l / L DTT4 %SDS0.2 % 溴酚蓝20 % 甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达(1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2 )按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。(3 )筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱，DNA序 列测定，确定无误后进行下一步。(4 )如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30 -32 C培养数小时，使培养液 的OD600达040.6，迅速使温度升至42 C继续培养3 -5h如果表达载体的原核启动子 为tac等，则37 C培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1 mmol / L。

5、继 续培养 3 -5h 。(5 )取上述培养液1 ml ,1000g离心，1 min，沉淀，加100 pL聚丙烯酰胺凝胶电泳 上样缓冲液后，作 SDS 检测。2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1 )细菌的裂解常用方法有：高温珠磨法;高压匀浆;超声破碎法;酶溶法;化学渗透等。 前三种方法属机械破碎法，并且方法、已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验 室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；B-1,3 -葡聚糖酶;B-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶; 糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：4 C

6、 ， 5000rpm 离心， 15 min ，收集诱导表达的细菌培养液(100 ml )。弃上清， 约每克湿菌加 3 ml 裂解缓冲液，悬浮沉淀。每克菌加8pL PMSF及80pL溶菌酶，搅拌20 min ;边搅拌边每克菌加4 mg脱 氧胆酸(在冷室中进行)。37 C ,玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20pL DNase I。室温放置至溶液不 再粘稠。(2 )超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎， 在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体 DNA 进行剪切，大大降 低液体的粘稠度。收集1 L诱导表达的工程菌，40 C , 5000

7、r pm离心，15 min ;弃上清，约每克 湿菌加3 mlTE 缓冲液。按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌;10 000g 离心， 15min ，分别收集上 清液和沉淀。分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2x凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS 。注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应 根据具体情况掌握;超声波破菌前，标本经 3 -4 次冻溶后更容易破碎。)包涵体的分离 蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Trit on-X100 / EDTA或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须 将洗涤过的包涵体

8、重新溶解并进行重折叠。(1 )试剂与配制洗涤液 I：0.5 % Triton X -10010 mmol / L EDTA (pH 8 .0 )溶于细胞裂解液中。2x凝胶电泳加样缓冲液。(2)细胞裂解混合物1 2 000g 离心， 15 min ,4 C ;弃上清，沉淀用 9x 洗涤液 l 悬浮; 室温放置5 min ; 12 000g离心15 min ,4 C ;吸出上清，用100 pL水重新悬浮沉淀;分别 取10 pL上清和重新悬浮的沉淀，加10 pL 2x凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS。)包涵体的溶解和复性(1 )试剂与配制缓冲液 I：1 mmol / L PMSF8mol /L 尿素1

9、0 mmol / L DTT溶于前述裂解缓冲液中。缓冲液II：50 mmol / L KH2PO4mmol / L EDTA (pH 8 .0 )50 mmol / L NaCImmol / L 还原型谷胱甘肽1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽 KOH 和 HCI 。2x凝胶电泳加样缓冲液。(2)用100 pL缓冲液I溶解包涵体;室温放置lh ;加9x缓冲液II,室温放置30 min , 用KOH调pH到10.7 ;用HCI调至pH 8 .0，在室温放置至少30 min ; 1000g离心，15 min，室温;吸出上清液并保留，用100 pL 2x凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀;取10 pL上清， 加10 pL 2x凝胶电泳加样缓冲液，与20 pL重新溶解的沉