(整理)DNA提取步骤

1、精品文档精品文档第20章细胞基因分离鉴定和原位杂交第一节细胞、的分离鉴定技术一、培养细胞基因组的提取及鉴定人和哺乳动物细胞基因组的分离通常是在有、等一类去污剂存在下，用蛋白酶消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经处理和纯化来提取N可用于细胞凋亡中对所引起断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍Y有关的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。一提取方法：取单层细胞，经无钙、镁洗一次，用胰蛋白酶消化，细胞悬液经洗次,弃上清，取细胞沉淀。加入细胞裂解液C8,/充分混匀，加入蛋白酶至终浓度为、终浓度为，混匀裂解蛋白呈糊

2、状。（3）5水0浴2小时，转入37水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止断裂，约分钟。.离心分钟（室温）取水相，再加入等体积酚氯仿同样颠倒混匀，去除蛋白质.离心分钟（室温）再重复步骤4再用等体积酚氯仿抽提一次取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀离心分钟（室温）取水相，加入倍体积的预冷无水乙醇，沉淀N混匀C放置小时离心分钟（室温）用乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥分钟。加入至终浓度，7水浴消化小时，消化污染的。加入蛋白酶至终浓度、至终浓度，混匀，水浴小时，加入至终浓度。（同用同入等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。（同吸2入上清，加入氯仿、异戊醇（24，:按同上

3、入法再抽一次。（同3取入水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-2加同小时。取沉淀用乙醇洗一次，真空干燥分钟后溶于少量中，C贮存。二纯度检测及含量计算浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长处，蛋白质则位于,分别测定后，其的比值应大于低于此值，说明中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于表明链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。取少许溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长处，其纯度应为OD260/OD280=1.8值为的溶液大约含0，故的浓度|J值xX稀释倍数。N总量J浓度JX总体积分子量大小测定，可用含溴化乙锭的琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移

4、距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组N进一步进行吸印分析。二、培养细胞总的提取及鉴定细胞中含有三类即、和，其中传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、等。提取细胞总的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的基因的法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总N也可从总中提取，从而分析表达量，建立文库，以及对

5、的调控和进行反义研究。变性液：盐酸胍，棕檬酸钠，B巯基乙醇。水平衡酚：在饱和酚中加入等体积处理的三蒸水或新鲜无菌的三蒸水混匀后去除水相，再重复处理二次即可。所用玻璃、塑料制品、金属器材可用水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用干烤小时，以去除被污染的酶。一总的提取方法：1、消化收集细胞方法同前。2向离心管中的细胞沉淀物中加变性液，立即充分混匀。3加入水平衡酚、乙酸钠、以及氯仿，剧烈振荡混匀秒后，立即置冰上放置分钟，离心分钟。、取水相，加入等体积酚氯仿混匀，剧烈振荡分钟，离心分钟。5、取水相，加入等体积氯仿，剧烈振荡10分钟，再同上离心，再如此反复抽提一次后取水相，加入等体积的预冷的异丙

6、醇|或异戊醇）混匀，低温放置20分钟，再同上离心。、取沉淀用预冷乙醇洗两次，干燥分钟，溶于处理的三蒸水中以溶解N分装,-2冻0存。二总的鉴定及含量计算纯度及含量测定取少量提取的，经紫外线扫描，吸收峰位于波长处，纯度为值为的溶液约含有0,故浓度P值x0JX稀释倍数。分子量大小鉴定配液：X电泳缓冲液配制t溶于,加入经t溶于,加入经过滤除菌，经处理的乙酸钠液中，用调整至处理的，再加经处理的水至总体积为避光室温保存。甲醛加样缓冲液：、溴酚兰、二甲苯青、甘油50%.2操作步骤：制平板胶：琼脂糖煮沸，冷却至,加入X缓冲液及甲醛溶液，使三者的比例为3.5:1，.或1三:者1的终浓度分别为1.、21%及10，

7、%于室温放置30分钟或更长时间，使胶凝固。（2在）无菌离心管中混合下列液体。最多XX电泳缓冲液甲醛3.5uL6温育515分钟，水浴冷却、离心加入处理的加样缓冲液上样，进行电泳，电压，小时直到溴酚兰至胶的中部，可用已知标本作分子量标准品，如或兔B球蛋白。电泳完毕，取出凝胶，浸泡在溴化乙锭溶液中终浓度染色分钟，紫外透射仪观察分子量大小。第二节核酸蛋白转移电泳及杂交一、及杂交本技术可用于基因组特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移固定

8、、特异性片断的分子杂交及放射自显影。一样品内切酶水解限制性内切酶可裂解双链N每种酶其特点是具有高度特异性的裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位活性是在小时内能将X所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行切割。1配液：X限制性酶消化缓冲液X无盐：1mg/mLBSA2100mmoL/LMgCL二硫苏糖醇X低盐：缓冲液0.5mol/LNaclX一高盐：缓冲液1.0mol/LNacl2、操作步骤：将22溶液加入管中并加入适量总体积为8，混匀。加入X限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同

9、的缓冲液。加限制性内切酶充分混合。（4）3温7育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。加入使达到终浓度为终止反应。消化后的直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或r二及杂交。将经电泳走在琼脂糖中的变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的N1、配液：变性溶液：（中2和）溶液：200mLXSS2C0X:在100mL1mol/LHCL加水至。中溶解和柠檬酸钠，加入数滴调至加水至,m压消毒灭菌。(预4杂)交液：12(5)X1D0en0ha25mL1PmOpoHl72K434X

10、SS1C25mL20X溶液鱼精去离子甲酰胺总体积为2液：聚蔗糖、操作步骤（如图20聚乙烯吡咯烷硐10g牛血清白蛋白组分加H2O至500ml精品文档精品文档液。硝酸时。或过精品精品文档精品文档精品文档精品文档XS室温X分钟2X分钟，气中干燥。将杂交后的膜曝光于光片，暗盒中放射自显影天，。片显影、定影，然后读片结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。二、及杂交此法是将分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行杂交，此法是研究特别是的主要方法之一，可测量的含量和大小。1配液：预杂交液：34TOC

11、o 1-5 h zXSSC125mL20X液鱼精DNA5mL5m去离子甲酰胺250mL10加至贮存2杂交液：预杂交液加入标记探针及磷酸葡聚糖。2、操作步骤：变性电泳方法同前待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于X中浸泡分钟，轻轻摇动。测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至X溶液；胶；硝酸纤维素滤膜；亲和层吸纸；吸水纸；重物、转移小时。（4取）出滤膜80烘烤2小时。用预杂交液，X预杂交过夜。将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入杂交液。去除预杂交液，加入含探针的杂交液，X,杂交过夜。按下列条件洗膜：X室温X分钟X室温X分钟曝光于光片暗盒中放射自显影天。显影，定影，

12、根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序,也可测含量。三、蛋白及分析此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术,是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上,固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序相似，故称为第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗同位素或非同位素的酶来检测，此方法可检测抗原蛋白。1、配液：转移电泳缓冲液：甘氨酸150mmol/L加粉甘氨酸于水中，加入甲醇，加水至6L丽春红溶液：丽春红乙酸1%、操作步骤（如图20）-：2WM用已带用一引上，在胶的阴在胶白置一张滤纸，将以加入电转移缓接

13、通目夜。将滤钢将分子量标准将滤钢中，封闭特手-1I-H附MW:If=二撇i微嬲:嬲1嬲小时或过印度墨水（8在）封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用洗四次，摇动。（9在）封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。将滤膜放在新配制的底物溶液中，大约分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。结果分析：分析阳性（显色滤条带的分子量大小，而且根据信号（颜色滤强弱分析蛋白表达量。第三节细胞的原位杂交技术原位杂交是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测或的技术，此方法原理是由或的序列与互补的标记单链探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位

14、的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。一、探针的制备原则和选择探针为或双链、单链N双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性,降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过

15、高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。探针的获得常采用随机引物延伸法的合成和扩增，可获大量的探针，或利用带有噬菌体强启动子多克隆位点的质粒载体来合成探针，也可利用质粒菌扩增质粒，经酶切后纯化的基因片断，均可以获得制备探针原料。这些探针可以用同位素标记，也可以用非同位素标记，即光敏生物标记或地高辛配基标记于脱氧脲嘧啶三磷酸核苷上形成的地高辛，可通过随机引物或缺口平移法与探针的核酸分子相连，构成地高辛一配基标记的核酸探针。比探针可用抗地高辛抗体偶联酶或荧光素通过松体结合和底物显色或产生荧光来检测。这些探针基本均有市售，无需自行制备，只要根据说明书使用即可。二、载玻片和盖

16、玻片预处理为了防止探针的非特异贴附而保证细胞粘附而需处理：1用于检测的载玻片的处理用洗载玻片分钟，再用无水乙醇洗数次使其干燥。（2在滤下列溶液中，65处理2小时X聚乙稀吡咯烷酮.固定在乙醇乙酸分钟，烘烤小时。2用于检测的载玻片的处理以涂载玻片。3对于盖玻片：于中浸泡分钟，用无水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180烤2小时。三、组织细胞固定理想的细胞固定过程应该保护细胞形态，同时确保目的基因或序列暴露。对于原位杂交有效的固定剂是多聚甲醛和（磷酸缓冲液、赖氨酸、过碘酸盐及重酪酸盐）。1、涂片细胞原位杂交固定用含有的洗涤细胞，于胰蛋白酶消化，收获细胞计数，涂载玻片上。若检测N固定于多聚甲醛7在C

17、下放分钟，洗分钟，系列乙醇脱水干燥，-20保存。若检测N固定在多聚甲醛小时，洗X分钟，浸泡在下述溶液中X分钟：TNi再用洗X分钟。在N蛋白酶K，溶液中，处理分钟，再用含有甘氨酸的洗X分钟。在乙酸中处理分钟，洗X分钟。注意：对于原位杂交多聚甲醛或福尔马林均可，但对于地高辛检测法必须用多聚甲醛，固定至少小时，而且用蛋白酶处理，这样可明显减少背景染色。四、原位杂交原位杂交与盐浓度、温度、甲酰胺浓度、等有关，复性的温度是,原位杂交，5最佳，杂交，可用较高温度，在范围内复性率基本上与无关。最好选用温和的碱性条件。甲酰胺有机溶剂可降低双链核酸的稳定性，可避免杂交过程中处于过高的温度，防止高温破坏组织。一同

18、位素标记探针的原位杂交同位素标记的探针，敏感性高，但要注意非特异结合，如标记探针在杂交前，用未经标记的预杂交，可减少非特异，可获较好的细胞内定位，此外还常用或标记探针，但放射线弱，自显影需天曝光，不太理想，方法如下：（胰取）已形成单层的细胞的盖玻片，悬浮细胞可采用离心法，将细胞粘附到涂有明胶的载玻片上。组织印片，冰冻切片等标本。（2将）标本浸入甲醇固定5分钟，再过3次4预冷的胰0三多氯醋酸。（3将）细胞片标本浸入70乙多醇脱水，空气干燥，这时培养细胞盖玻片应该用中性树胶固定于载玻片上，注意细胞面向上。（4将）细胞片放置在金属盘内，并将托盘放入43水浴箱中预热。直接向固定的细胞面滴加含探针杂交液

19、，然后用盖玻片覆盖，其边缘用橡胶液封闭。（6）4恒3温水浴箱内培养18小时，此间保持箱内高湿度，防止因盖玻片封闭不严导致杂交缓冲液干涸。（7反）应结束后，将玻片置于冰块上，用镊子小心剥下盖玻片周边的橡胶，将载玻片浸入垂直X溶液中，使盖玻片脱落。将载玻片放入湿盒中，加X溶液浸没玻片，加盖玻片并用胶带封闭湿盒。然后，将湿盒移入水浴箱中53处理30分钟。在8用X洗玻片次，每次分钟。（10玻片）浸入70乙%醇脱水，空气干燥。（11将）干燥后的干燥标本浸入新配制的核4乳胶液（核4乳胶液蒸馏水=1）:，1垂直取出玻片，用滤纸擦去背面多余胶，室温干燥5小时（在暗室中进行）。用黑纸包裹标本放在冰箱曝光（标记的

20、探针通常需周，有时需长达天，可造成高背景，而不理想）。（13按）常规显影、定影、水洗。对标本进行或染色、脱水、封片。结果分析：镜下观察，如需定量，可在镜下计数银颗粒或拍摄显微照片，用图象分析仪进行灰度分析。二同位素标记探针的原位杂交TOC o 1-5 h z探针容易制备，合成率较高，成本低，易纯化，可提高检测敏感性。-杂交比杂交稳定，能适应更多的条件。（1标标本处理同前将标记探针溶于杂交缓冲液中（X放射强度）。去离子甲酰胺XX液M变性鱼精分钟每张载玻片上滴加杂交液，使每张载玻片探针总量为Xp用一硅化的盖玻片盖住，封以不透性矿物油，在利于探针的温度下（常为）杂交小时。用氯仿洗数次，去除矿物油，室温下使盖玻片在X液中滑落，再滴加去离子甲酰胺，X液，杂交温度下分钟，室温X洗分钟，用0在X中消化去除单链，再滴加去离子甲酰胺，X室温分钟，室温下用X洗分钟。（5将标切片脱水，浸入由1甘%油稀释的放射自显影乳剂（1:）1中，放入暗盒中，在有硅胶干燥剂存在下,存放天（或者曝光于光胶片小时），随后浸于液体乳剂。用染色。三地高辛标记的探针原位杂交放射性同位素标记探针缺点是有放射损伤，易污染环境，需特殊防护和实验条件，有半衰期受限、标记不稳定