分子生物学实验原理与常见问题解答课件

1、 宁夏疾控中心病毒科 马江涛分子生物学实验原理与常见问题解答RNA提取原理与注意事项PCR原理与常见问题Real-time PCR介绍内容商品化提取试剂盒原理： 异硫氰酸胍（GIT）-酚法 GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA； GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；一定条件下（各家试剂条件不同），RNA不溶于乙醇，而DNA和蛋白质溶于乙醇溶液，通过滤柱时，RNA挂柱， DNA和蛋白质溶于滤液；在逐步洗脱的过程中，RNA不断被纯化；最后用水洗脱。 杜绝外源酶的污染：严格戴好帽子，口罩，手套。 实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，

2、实验台面等要彻底处理。 实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 RNA提取的注意事项（外界环境中多含Rnase，且RNA极不稳定）RNase freeDNase free 阻止内源酶的活性： 选择合适的匀浆方法。 选择合适的裂解液。 控制好样品的起始量。 PCR技术的基本原理 模板DNA的变性：93-95左右， 模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-35 引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5-3DNA聚合酶活性变性-退火-延伸三个步骤 引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）复性温度=Tm值-（510） 在Tm

3、值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束标准的PCR反应体系（100ul体系） 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引

4、物 10100pmol 模板 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素模板 （template）引物（primer）酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） Mg2+ （magnesium）（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）T

5、aq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。PCR常见问题无扩增产

6、物非特异性扩增拖尾假阳性 无扩增产物现象：阳对照有条带，而样品则无M样品A样品B阳性对照 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多 原因重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数 对策 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M 1 2模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多 原因纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适

7、量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数 对策靶序列或扩增产物 的交叉污染 原因开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外更换试剂、耗材试剂分装，贮存适当。更换实验室和所有试剂耗材。假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物对策 PCR中应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照： 阳性模板阴性对照： 阴性模板试剂对照： 除模板外的所有组分Real-time PCR技术介绍实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量

8、分析的方法 实时荧光定量PCR 原理 实时原理 常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理 定量原理介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）； 纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧

9、光定量PCR 原理 -荧光阈值荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR 原理 -Ct值Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value 实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光

10、信号量相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定，误差大；Ct值则极具重现性 起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；终点量经过PCR 放大， 并非研究所期望的数据非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon实时荧光定量PCR的几种方法介绍SYBR Green 法SYBR Green 法 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green

11、发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBR Green 实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitation实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度-TaqMan法与目标序列互补TaqMan-水解型杂交探针 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收

12、，无荧光， R与Q分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，FRET） Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法 工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光Texas Red, ROXCY3.5, Redmond Red常用的荧光基团FAMTET, VICCY5CY5.5, LC705LC640HEXJOECY3TAMRA实时荧光定量PCR 方法 3 - Molecular beacon 法(分子信标)标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针Molecular beacon (分子信标) 工作原理

13、荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号 由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探针设计一般应符合以下条件：探针长度应在2040个碱基左右，保证结合特异性。GC碱基含量在40%60%，避免单核苷酸序列的重复。避免与引物发生杂交或重叠。探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。 特 点FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变