重组蛋白药物一般生产工艺与质量控制要点课件

1、1重组蛋白药物一般生产工艺与质量控制要点起草人/日期： . 批准人/日期： . 审核人/日期： . 文件编号： T09-SS10生效日期： 年 月 日版本号：01培训目的及范围培训目的1、熟悉生物制品一般生产工艺及质量控制要点。2、了解检验项目设置缘由及控制标准。培训范围1、QC部2、QA部23蛋白质的基本性质1、蛋白质大小（一般5-10nm）2、蛋白质形状3、蛋白质核电性4、蛋白质等电点（一般4.0-10.0）5、蛋白质疏水性6、蛋白质溶解度7、蛋白质密度（一般1.3-1.4g/cm3）8、蛋白质与配体结合能力（酶，抗体）9、蛋白质与金属螯合能力（CU2+、ZN2+、CA2+、NI2+）10

2、、蛋白质其它特殊性质(抗热性、抗蛋白酶)基本知识4第一部分：重组蛋白药物一般生产工艺第二部分：重组蛋白药物质控要点第三部分： 注射用重组人胸腺肽1与注射用重组白介素-2（125SER）生产工艺第四部分：注射用重组人胸腺肽1与注射用重组人白介素-2(125SER)质量控制标准培训内容第一部分：重组蛋白药物一般生产工艺第一步：工程菌构建第二步：菌体发酵与诱导表达第三步：目标蛋白提取与纯化第四步：配液与冻干5重组蛋白药物一般生产工艺目标产物鉴定基因序列测定表达产物结构确证特异性鉴别实验N末端氨基酸序列分析氨基酸组成分析C末端氨基酸序列分析激光解析飞行时间质谱分析X射线晶体衍射分析7重组蛋白药物一般生

3、产工艺原始菌种鉴定宿主菌鉴定（显微镜、电镜检查，生化反应，对抗生素抗性，质粒检查）质粒检查-遗传稳定性外源因子有：1、细菌检查2、霉菌检查3、支原体检查4、噬菌体检查8重组蛋白药物一般生产工艺10第三步：目标蛋白分离与破碎重组蛋白药物一般生产工艺11第三步：目标蛋白分离与破碎重组蛋白药物一般生产工艺第三步：目标蛋白纯化12重组蛋白药物一般生产工艺蛋白纯化方法14分离方法蛋白质性质基础分离方法蛋白质性质基础沉淀法层析法 硫酸铵溶解度 离心交换层析电荷及分布 丙酮溶解度 疏水作用层析疏水性 聚乙烯亚胺电荷、大小 反相层析疏水性、大小 等电点溶解度、等电点 亲和层析配体结合双水相法溶解度 外源凝集素

4、亲和层析糖基内容与种类电泳法 凝胶电泳电荷、大小、形状 金属亲和层析金属螯合能力 等点聚焦电泳等电点 免疫亲和层析特异抗原位点离心法大小、形状、密度 层析聚焦等电点超律法大小、形状 凝胶过滤层析大小、形状重组蛋白药物一般生产工艺蛋白纯化原理亲和层析离子交换层析疏水层析凝胶过滤层析反相层析15重组蛋白药物一般生产工艺第四步：配液与冻干生物制品药用辅料按使用目的，分为：疫苗培养液生物制品稳定保护剂（人血白蛋白，糖类）免疫佐剂（铝盐，植物油类）防腐剂(硫柳汞与苯酚)脱毒剂与灭活剂（甲醛溶液与b-丙内酯）冷冻干燥保护剂（盐类，糖类，醇类）17重组蛋白药物一般生产工艺冻干过程预冻干一次升华二次升华18重

5、组蛋白药物一般生产工艺典型冻干曲线19第二部分：重组蛋白药物质控要点原辅料、包材、菌种发酵液、原液半成品、成品20重组蛋白药物质控要点原辅料-符合药典和生物制品主要原辅料质控标准等-略包材-符国家药品包装容器（材料）标准-略菌种-符合药典或注册要求发酵液-符合药典或注册要求原液-符合药典或注册要求半成品-符合药典或注册要求成品-符合药典或注册要求21重组蛋白药物质控要点菌种：一般检测项目22中间体名称质量标准检测项目合格标准菌种划种LB平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长染色镜检应为典型的革兰阴性杆菌对抗生素抗性应与原始菌种相符电镜检查应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微

6、生物污染生化反应应符合大肠杆菌生物学性状表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种表达量质粒检查质粒酶切图谱应与原始重组质粒相符目的基因核苷酸序列检查符合规定质粒稳定性符合规定质粒检查质粒酶切图谱应与原始重组质粒相符重组蛋白药物质控要点原液：一般检测项目241生物学活性（有效项目）2蛋白含量（有效项目）3比活测定（有效项目）4纯度测定（有效项目）5分子量（鉴别项目）6紫外吸收光谱（鉴别项目）7肽图（鉴别项目）8等电点（鉴别项目）9N-末端氨基酸序列测定（鉴别项目）10外源性DNA含量（安全项目）11宿主菌蛋白残留量（安全项目）12圆二色谱分析（鉴别项目）12细菌内毒素（安全项目）重组蛋白药物质控要点

7、原液：生物学活性检测生物学活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段。参照中国药典标准中的规定及注册质量研究资料，采用脱E受体法或MTT比色法检出本品，专属性强、方法可靠。25重组蛋白药物质控要点原液：比活测定检测比活性是指单位重量蛋白的活性，反应单位蛋白活性的高低。是活性生物制品的重要指标和检测依据。27重组蛋白药物质控要点原液：纯度检测根据人用重组DNA产品质量控制技术指导原则有关要求，应用至少两种不同原理的方法进行纯度分析，且纯度均不得低于95.0，才能判为合格。因胸腺肽a1与白介素-2（125Ser）在临床上使用剂量在毫克级，故纯度要求应较严格。高效液相法本检测采用protein

8、C18反相色谱柱，可精确地测定产品的纯度，及对空间构相作初步分析。一般尽量采用与SDSPAGE法原理不同的RPHPLC或其它离子交换HPLC法进行分析，而不采用SECHPLC进行分析。电泳法用SDSPAGE法分析，可将不同分子量的蛋白质分开，从而测定蛋白质的纯度，通过凝胶扫描仪扫描进行纯度分析。样品在凝胶电泳上显现出条区带，说明样品在该电泳条件分子量是一致的，为分析是否存在相同分子量的杂蛋白，还应选择另一种方法进行纯度分析。28重组蛋白药物质控要点原液：分子量检测分子量是蛋白质理化性质之一。一般采用还原型SDS法测定，蛋白质在SDS和B-巯基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面带大量负电荷的杆状

9、分子，降低了分子形态和电荷的影响，在电泳过程中蛋白迁移率基本只与其分子量相关，目前广泛用于蛋白分子量的测定。该法具有简便，快速，直观等特点，目前作为基因工程药物原液检定的常规方法。该法可将蛋白质按分子量大小进行分离，因此，可用于蛋白质纯度分析，同时还能对聚合体进行分析。29重组蛋白药物质控要点原液：紫外光谱扫描检测这是基因工程药物的一个重要物理常数，对于一个蛋白质来说，它的最大吸收波长是固定的。对某一重组蛋白质来说，其最大吸收波长是固定的；在生产过程中每批产品的紫外吸收光谱应当是一致的。测定时以生理盐水为对照，在200350 nm范围内对待检样品溶液进行扫描，每批制品紫外吸收图谱应与对照品一致

10、且在280nm附近最大吸收波长应与理论值相符。30重组蛋白药物质控要点原液：肽图检测肽图分析是DNA产品质控的重要手段之一。通过肽图分析，可从一级结构研究重组产品与天然品的同质性。重组产品与天然产品具有相同的指纹图谱，它们具有相同的一级结构。进一步验证了它们的同质性。大多基因工程产品都将肽图分析作为控制其一致性的重要常规指标之一，而采用的方法中又以HPLC肽图分析最为多见。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征和专一的。因此可用于检查各批产品蛋白质一级结构的一致性在肤图分析中的应用基因重组药物的肽图分析是评价基因重组制品和天然蛋白质的同一性以及不同批制品间同一性的重要手段，也是证明细胞遗传稳定性的有效

11、手段之一。31重组蛋白药物质控要点原液：等电点检测不同蛋白质由于某些带电氨基酸带负电荷的Glu，Asp和带正电荷的Lys，Arg,His等的存在，其净电荷各不相同，即等电点各不相同。均一的蛋白质只有一个等电点，有时因加工修饰等影响可出现多个等电点，但应有一定的范围。所以等电点测定是控制重组产品生产工艺稳定性的重要指标。32重组蛋白药物质控要点原液： N-末端氨基酸序列测定可以确证表达产物的编码准确性。对蛋白质的全氨基酸序列分析，难度大，耗时长，从统计学观点只要测定N-末端15个氨基酸便可保证其顺序的正确性。故N-末端15个氨基酸序列分析可作为重组蛋白质的重要鉴别指标。 33重组蛋白药物质控要点

12、原液：外源性DNA含量检测宿主细胞DNA只作为一种细胞污染因素而不作为一种危险因素。目前均采用DNA杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检测试剂盒或者用同位素标记DNA探针进行测定，必须提供相应宿主细胞DNA标准品。由于设备和消耗试剂昂贵，一定程度限制了该方法的普及。由于基因工程药物的生产过程中所使用的各种表达系统中都含有大量的DNA。因此世界各国的药品管理机构都对基因工程药物中所允许的DNA残余量严加限定。WHO和FDA将此限量定在100pg剂量。参照药典三部附录IX B外源性DNA残留量测定法每1次人用剂量应不高于10ng。34重组蛋白药物质控要点原液：宿主菌蛋白残留量检测如在临床使用

13、中需要反复多次注射的药品，则需要做残余菌体蛋白含量测定，所用方法以双抗体夹心ELISA为宜，尽量不用点免疫。因为用点免疫测菌体蛋白含量，实验结果不客观，主要是因为检品和菌体蛋白标准难以在同等条件下进行直接点膜，当检品浓度较高时，在硝酸纤维膜上形成一定厚度的样品模块，影响了菌体蛋白与膜的结合，导致测定结果偏低。不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同，如来自大肠杆菌的产品为不大于01 ；来自CHO细胞表达产品为不大于005。本检品中宿主蛋白含量应不高于总蛋白的0.1%。35重组蛋白药物质控要点原液：圆二色谱分析对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象，这种吸收程度的不同与波长的关系称圆二色谱，是测定分子

14、不对称结构的光谱法。用于测定蛋白质的立体结构，核酸和多糖的立体结构。在蛋白质分子中，肽链可形成-螺旋、-折叠、-转角等特定的立体结构。这些立体结构都是不对称的。36重组蛋白药物质控要点原液：圆二色谱检测蛋白质的肽键在紫外185240纳米处有光吸收，因此它在这一波长范围内有圆二色性。几种不同的蛋白质立体结构所表现的椭圆值波长的变化曲线圆二色谱是不同的。-螺旋的谱是双负峰形的，-折叠是单负峰形的，无规卷曲在波长很短的地方出单峰。蛋白质的圆二色谱是它们所含各种立体结构组分的圆二色谱的代数加和曲线。因此用这一波长范围的圆二色谱可研究蛋白质中各种立体结构的含量。蛋白质含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它们在2

15、40350纳米处有光吸收,当它们处于分子不对称环境中时也表现出圆二色性。这一范围的圆二色性反映出在蛋白质分子中上述氨基酸残基环境的性质。37重组蛋白药物质控要点原液：细菌内毒素检测细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分,当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素.因此,细菌内毒素广泛存在于自然界中.当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害,但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病.内毒素小量入血后被肝脏细胞灭活,不造成机体损害.内毒素大量进入血液就会引起发热反应“热原反应”.因此,生物制品类,注射用药剂,化学药品类,放射性药物,抗生素类,疫苗类,透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器,植入

16、性生物材料）必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。按照药典三部注射剂通则，需要检测细菌内毒素的含量，采用鲎试剂法。由于鲎试剂法简单快速灵敏准确,目前已广泛用于临床,制药工业药品检验等方面。38重组蛋白药物质控要点半成品：一般检测项目可见异物（安全项目）无菌检查（安全项目）细菌内毒素（安全项目）39重组蛋白药物质控要点半成品：可见异物检测“可见异物”是指目视可以观测到的玻璃屑、金属屑、长度或最大粒径超过2mm的纤毛和块状物等外来异物。“其他可见异物”则是指长度或最大粒径在2mm以下的短纤毛及白点、白块等。这些物质进入人体静脉能够堵塞血管，形成血栓。危害人体健康。按照药典三部的注射剂通则要求，

17、检查可见异物，并符合规定。注射剂，滴眼剂应在符合药品生产管理规范的条件下生产，产品在出厂前应采用适宜的方法逐一检查并同时剔除不合格产品。40重组蛋白药物质控要点半成品：无菌检查无菌检查法系用于确定要求无菌的生物制品，原料，辅料及要求无菌的其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明供试品在该检验条件下未发现微生物污染。本法参照药典三部的无菌检查法，应符合规定。半成品：细菌内毒素略41重组蛋白药物质控要点成品：一般检测项目42检测项1、鉴别试验（鉴别项目）7、水分测定（安全项目）13、I诱导物残留量检查（安全项目）2、外观（安全项目）8、活性测定（有效项目）14、有机溶剂残留

18、量检查（安全项目）3、复溶时间（安全项目）9、含量检查（有效项目）15、抗生素残留量检查（安全项目）4、可见异物（安全项目）10、无菌检查（安全项目）16、异常毒性检查（安全项目）5、装量差异（有效项目11、细菌内毒素检查（安全项目）17、渗透压摩尔浓度检查（安全项目）6、PH值（安全项目）12、HBsAg检查（安全项目）18、不溶性微粒检查（安全项目）重组蛋白药物质控要点成品：鉴别实验主要确定供试品的抗原性，根据抗原抗体特异性反应建立的方法。将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双相免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原，抗体生成的沉淀弧的位置和

19、形状进行比较。分析供试品中成分及其性质。43重组蛋白药物质控要点成品：外观因质量研究本制品冻干样品为白色无杂色的疏松体，所以成品检验质量标准为白色或微黄色疏松体。成品：复溶时间检查法：按标示量加入2025灭菌注射用水，轻松摇动，应于15秒内完全溶解。应与质量标准一致。44重组蛋白药物质控要点成品：可见异物“可见异物”是指目视可以观测到的玻璃屑、金属屑、长度或最大粒径超过2mm的纤毛和块状物等外来异物。“其他可见异物”则是指长度或最大粒径在2mm以下的短纤毛及白点、白块等。这些物质进入人体静脉能够堵塞血管，形成血栓。危害人体健康。按照药典三部的注射剂通则要求，检查可见异物，并符合规定。注射剂，滴

20、眼剂应在符合药品生产管理规范的条件下生产，产品在出厂前应采用适宜的方法逐一检查并同时剔除不合格产品。45重组蛋白药物质控要点成品：装量差异按照药典三部的注射剂通则要求进行装量差异检查。除制剂通则中规定检查重量差异的制剂及放射性药品外，按上述方法检查，应符合规定。成品：pH值根据质量研究资料，胸腺肽a1在PH6.3-7.8条件下稳定，规定本品酸碱度为6.3-7.8,白介素-2（125Ser）在PH6.5-7.5质检性质稳定。46重组蛋白药物质控要点成品：水分测定水分检测主要指对冻干制剂的要求，是重要的质量和经济指标之一，在一般情况下要控制水分低一点，防止微生物生长，但是并非水分越低越好。通常微生

21、物作用比生化作用更加强烈。目前美国药典和欧洲药典公认的标准为不超过3.0% ，所用的方法有费休氏法。成品：活性测定略成品：含量测定略成品：无菌检查略47重组蛋白药物质控要点成品：细菌内毒素检查略成品：HBsAg检查乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。检查HbsAg的目的是为了控制乙肝表面抗原蛋白在制品中的含量。采用ELISA双抗体夹心法，即酶联免疫吸附法，包被HBsAb于琼脂微孔与标本中的HBsAg形成Ab-Ag复合物，再于酶标HBs抗体结合，加入TMB底物产生显色反应。48重组蛋白药物质控要点成品：诱

22、导物残留量检查IPTG作为大肠杆菌和哺乳动物细胞等的表达诱导剂，一般以1mM左右的浓度加入液体培养基中。在本工艺中使用了IPTG作为诱导剂，在培养液中的终浓度为0.5-1mM。发酵完毕后，经过菌液离心分离、包含体分离、凝胶过滤、反相层析、旋转蒸发等多步纯化，可以有效地去除IPTG残留，故IPTG残留量甚微。Liu HS 等人的研究也表明，IPTG在一定的浓度范围内（5mM），对细胞是没有毒性的。而5mM 的IPTG浓度是生物制品IPTG残留检测值（极限值以下）浓度的四百万倍。49重组蛋白药物质控要点成品：有机溶剂残留量检查在原料、辅料、制剂制备过程中未能完全除去的有机溶剂。按照与ICH残留溶剂

23、指导原则与HGPH7-1化学药物残留溶剂研究的指导原则为依据制定药典标准第一类：避免使用第二类：限制使用第三类：GMP或其它质量要求限制使用第四类：尚无足够毒理资料的溶剂50重组蛋白药物质控要点成品：抗生素残留量检查抗生素的滥用已经引起大量的耐药菌株的出现，严重威胁了人类健康。在生物制品中应严格规定抗生素的含量。本工艺需在种子制备和发酵过程中使用抗生素，故需要在成品中检测抗生素的残留。按照药典三部的抗生素残留量检查方法应为阴性。成品：异常毒性检查主要检查目标产物以外的有毒物质.目的是通过动物试验检查制品中外源性毒性物质的污染情况以及是否存在意外的不安全因素，以保证人体使用安全。51重组蛋白药物

24、质控要点成品：渗透压摩尔浓度检查生物膜具有半透性，在涉及溶质的扩散和转运过程中，渗透压起着重要作用。因此在制备注射剂和眼用制剂时，必需关注其渗透压。正常人体血液的渗透压摩尔浓度范围为285-310mOsmol/kg,0.9氯化钠溶液和5%葡萄糖溶液的渗透压摩尔浓度与人体血液相当。52重组蛋白药物质控要点成品：不溶性微粒检查药典标准（注射用无菌粉末）：每容器（份） 10um微粒不过6000粒， 25um微粒不得过600粒。不溶性微粒进入人体会血栓，热原反应，器官病理，肉芽，血液凝结，变态反应，即使微粒直径712m，即使检验符合的注射剂中的异物 ，一旦进入极细的血管中可立即引起阻塞 ，造成损伤或坏

25、死。53第三部分：注射用重组人胸腺肽1与注射用重组人白介素-2（125SER）生产工艺注射用重组人胸腺肽1生产工艺注射用重组人白介素-2（125Ser）生产工艺注射用重组人胸腺肽1与注射用重组人白介素-2生产工艺对比54注射用重组人T1与白介素-2生产工艺注射用重组人胸腺肽1生产工艺55注射用重组人T1与白介素-2生产工艺56注射用重组人白介素-2生产工艺注射用重组人T1与白介素-2生产工艺注射用重组人T1与白介素-2生产工艺对比57序号胸腺肽1白介素-2(125Ser)1大肠杆菌表达体系（BL21(DE3) / pTRX-T1）大肠杆菌表达体系（PBV220/125Ser-IL-2/DH5）2重组质粒表达（pTRX-T1）重组质粒表达（PBV220/125Ser-IL-2）3高密度发酵（胞内表达）低密度发酵（包涵体表达）4机械破碎超声破碎5亲和层析包涵体变性6超滤与酶切凝胶过滤（分子筛）7亲和层析凝胶过滤（脱盐）8凝胶过滤氧化复性9反相层析反相层析10凝胶过滤旋蒸第四部分：注射用重组人胸腺肽1与注射用重组人白介素-2(125SER)质量控制标准注射用重组人胸腺肽1质量控制标准注射用重组人白介素-2(125SER)质量控制标准58注射用重组