蛋白质含量测定方法归纳

1、实验七 蛋白质含量测定测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲 (Biuret) 法，酚试剂法(Lowry) 法及紫外吸收法。 目的要求 1掌握测定蛋白质的含量基本方法。了解染料法、双缩脲法、 Lowry 法和紫外吸收法测定原理。一、染料法 实验原理 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合， 此时考马斯亮蓝 G-250 颜色从红 色变为蓝色，吸收高峰从 460nm 移至 595nm 。利用这个原理可以测定蛋白质含量。该法近年在某些方面有取代经典的 Lowry 法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染 料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基

2、酸组成有较大 差异的蛋白质， 有一定误差， 因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的， 故该法适合测定与 标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 器材 吸量管； 试管； 721 型分光光度计试剂标准牛血清白蛋白溶液：配成 0.1mg/ml 的溶液。待测蛋白质溶液。染料溶液：称取考马斯亮蓝 G-250 0.1g 溶于 95% 的酒精 50ml ，再加入 85% 的浓 磷酸 100ml ，用水稀释至 1000ml, 混匀备用。操作步骤1.标准曲线的绘制:试剂管号012345标准蛋白溶液00.20.40.60.81.0H2O1.00.80.60.40.20染料溶液5.05.05.05.05.05.0A595

3、nm按上表分别向各支试管加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm 波长处以0号管调零，测定各管吸光度值(A )。以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。样品测定：取1ml样品溶液(约含25250微克蛋白质)，加入染料溶液 5ml混匀，5min后 测定其595nm 吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量实验原理在碱性溶液中，双缩脲 (H 2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(一CO-NH 2)，或与此相似的基团如一CH2-NH 2, CS-NH 2， C(

4、NH)NH 2的任何化合物，无论这类基团直接相连 还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(CO-NH ),可发生双缩脲反应， 且呈色强度在一定浓度围与肽键数量即与蛋白质含量成正 比，可用比色法测定蛋白含量。测定围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速， 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。 主要的缺 点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。试剂 双缩脲试剂： 取CuS0 4 5H20（c.P.）1.5g和酒石酸钾钠（c.P.）6.0g以少量蒸馏水溶 解，再

5、加2.5mol / L NaOH 溶液300ml , KI 1.0g，然后加水至 1000ml。棕色瓶中避 光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。.标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白 （BSA ）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用 BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白 质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH 配制。器材1 .试管：15 X150mm试管7只；1ml , 5ml 移液管；.

6、坐标纸;. 721分光光度计。操作步骤取试管7支，编号，按下表操作:试剂管号空白12345测定管管蛋白标准液（10g/L ）- 0.10.20.30.40.5-生理盐水0.50.40.30.20.1-0.4待测样品-0.1双缩脲试剂3.03.03.03.03.03.03.0相当蛋白质（g/L ）01020304050混匀，37 C水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm 处，用空白管调零，读取各管吸光度值。15为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质 浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度，在标准曲线上求得蛋白质浓度。注意事项.双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu 2

7、+形成稳定的络合铜离子， 以防止CuSO 4 5H 20 不稳定形成 Cu（OH） 2沉淀。酒石酸钾钠与 CuSO4 5H20之比不低于3 : 1，加入KI作为抗 氧化试剂。双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。思考题双缩脲法测定蛋白质的原理是什么？其它还有什么方法测定蛋白质的含量？.请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法（除标准曲线法外）。三、酚试剂法测定血清蛋白质含量（改良Lowry法）实验原理蛋白质分子中所含肽键在碱性条件下与铜络合生成复合物产生紫红色

8、化合物（双缩脲反应），同时使肽链展开，蛋白质中半胱氨酸、络氨酸、色氨酸和组氨酸均能使钨酸、钼酸同 时失去1个，2个或者3个氧原子，还原成多种还原型的混合酸，并且有特殊的蓝颜色大吸收峰波长为745750nm,反应式一）其蓝色深浅与蛋白质含量在一定围成正比，由此 可测出样品中蛋白质的含量。同时蛋白质肽键发生烯醇化反应（反应式二）能使钼离子在 pH10时螯合在肽结构中，形成复合物，从而使电子转移到混合酸的显色剂上，大大增加了 酚试剂对蛋白质的敏感性。反应式一3H 2OP2O5?13WO 3?5MoO 3?10H 2O3H 2OP2O5?14WO 3?4MoO 3?10H 2O（最反应式3H 2OP2O5?13WO 2?5MoO 3?10H 2O3H 2OP2O5?14WO 2?4MoO 2?10H 2O烯醇化反应烯醇化反应