结肠癌肿瘤自身抗体谱筛选及其应用

1、结肠癌肿瘤自身抗体谱挑选及其应用结肠癌是在欧美国家发病率位居第二的癌症，在我国结肠癌的发病率目前排第五位。近年来，其发病率还在逐年上升。目前早期结肠癌的诊断率仍很低，约1/4的患者在初次确诊时已有远处转移，其中50%是肝转移。最新的肿瘤免疫学研究认为，病人可对自身肿瘤抗原产生体液免疫应答1。正常细胞向癌细胞转化过程中，突变的基因或各种异常表达的蛋白可以成为肿瘤抗原诱导机体的免疫反响，在肿瘤患者血清中可以检测到肿瘤相关抗原的自身抗体谱2。进一步的研究发如今肿瘤患者和正常人的血清中肿瘤自身抗体谱存在显著差异3，提示自身抗体谱有可能作为肿瘤早期诊断的新型血清标志物。基于这个理论，我们构建患者结肠癌组

2、织的dna表达文库，挑选了结肠癌相关自身抗体谱，并讨论将其作为结肠癌早诊的血清学标志物的可能。1资料和方法1.1资料结肠癌组织来自中国医学科学院肿瘤医院收治的1例男性结肠癌患者，病理诊断为低分化型腺癌，肝多发转移，淋巴结转移6/18，为本院腹部外科手术切除，手术同时取该病人血清。其他30例结肠癌术前病人血清来自本院检验科。手术获取的癌组织和患者血清及30例安康正常自愿者的血清采集后立即冻于-80备用。1.2方法nbigenbakdatabase中进展分析，主要包括核苷酸序列同源性分析、读码框分析等。1.3统计学方法统计各个阳性克隆在正常人及结肠癌病人血清中的抗体阳性率，用2检验进展统计学处理。

3、2结果2.1构建库容为5105pfu的人结肠癌dna表达文库共提取rna10g,d260d280值为2.05,说明其纯度较高，1%琼脂糖凝胶电泳显示其为从9.40.5kb的弥散，主要集中于1.52.0kb左右，说明提取的rna质量较好，没有明显的降解。以提取的5g结肠癌组织rna为模板，在合成dna第一链和第二链的同时随机掺入32p。电泳后放射自显影显示，第一链为介于9.00.5kb的弥散，大部分集中于1.52.0kb左右,无明显的条带；dna第二链的范围比第一链稍大，为介于10.00.5kb的弥散，大部分集中于1.52.0kb左右，也无明显的条带。结果说明，利用高温反转录酶成功地对rna进展

4、了反转录，合成的dna第一链涵盖了绝大多数的rna分子，造成随后合成的第二链同样涵盖了绝大多数的rna分子。取100ngdna与zapexpress载体连接后，用gigapakgldlningkit提供的包装蛋白进展包装。获得库容为5105pfu的结肠癌组织dna表达原始文库。文库不经扩增直接用于抗原筛眩2.2从结肠癌组织dna表达文库中挑选出了33个与患者血清反响的克隆a：第一轮挑选；b：第二轮筛眩实心箭头所示为第一、二轮挑选的阳性克隆，空心箭头为在第一轮挑选中呈阳性而在第二轮挑选中呈阴性的克隆图1文库血清学挑选得到的阳性克隆2.3同源性分析阳性克隆基因代表29个不同基因对获得的33个阳性克

5、隆首先进展内部剪切。用eri和xhi双酶切鉴定外源插入片段的大校其中31个阳性克隆剪切成功，片段大小在0.52.0kb之间。将这些克隆进展核苷酸序列测定。核苷酸序列显示31个克隆代表不同的抗原分子。进入genbank进展est同源性比较发现，有29个克隆与genbank已有的est具有较高的同源性，如表1所示。余下2个克隆的序列与genbank已报道的est或基因的外显子序列无明显同源。表1部分结肠癌dna表达文库的阳性克隆的同源性分析2.4阳性克隆与正常人血清反响性明显低于结肠癌患者我们检测了4个阳性克隆与30例结肠癌患者血清和30例正常人血清的反响情况。图2是1克隆与5例结肠癌和5例正常人

6、血清的反响情况。1克隆与肿瘤患者的血清反响明显强于正常人血清。1、29、21克隆在正常人血清中抗体阳性率较低，均小于23%，而在结肠癌病人血清中抗体阳性率较高均大于77%，见表2，2检验结果显示有显著性差异p0.01，提示其有可能成为结肠癌早期诊断的血清学标志物。14与正常人和结肠癌患者血清的反响性相似。以1、29、21三个克隆中任意一个阳性为诊断标准，那么对上述30例癌和30例正常的诊断特异性和敏感性分别达90%和70%。假如以1、29、21三个克隆中任意两个阳性为诊断标准，那么对上述30例癌和30例正常的诊断特异性和敏感性分别达80%和100%。a：肿瘤血清；b：正常血清图21克隆与5例结

7、肠癌阳性反响和与5例正常人血清阴性反响表21、29、21、14与正常人及结肠癌病人血清反响的阳性率克隆号正常血清阳性率病人血清阳性率卡方检验123%(7/30)76%(23/30)p0.01296%(2/30)80%(24/30)p0.01210%(0/30)77%(23/30)p0.011466%(20/30)73%(22/30)p0.053讨论本研究采用serex技术对结肠癌肿瘤自身抗体谱进展了研究，获得了31例阳性克隆，代表了31种结肠癌肿瘤自身抗体。其中有两个克隆与的est和人的dna外显子序列无明显同源，有报道这些序列表达的肽段可能是模拟了某些抗原分子的表位而被肿瘤自身抗体所识别8。

8、其余29例阳性克隆包括人线粒体基因，自身抗原，分子伴侣，dna修复酶，细胞膜外表蛋白，核糖体蛋白及一些目前功能尚未确定的基因等，其中既有发生了点突变及缺失的基因，也有未发生突变的基因。比方，3是人跨膜蛋白酪氨酸激酶同源蛋白,i型糖尿病自身抗原，属于癌症非依赖性自身抗原。4、22、21、23、27均为人线粒体基因组片段，8、15均为核糖体蛋白，应属于癌症相关自身抗原，其在正常组织及肿瘤组织均有表达，在肿瘤坏死时被暴露出来，从而被免疫系统所识别，发生体液免疫应答。其中1，尿嘧啶dna糖基化酶，主要参与dna复制时错配的修复；14人apex核酸酶(多功能dna修复酶)基因；二者都参与dna的复制及修

9、复。这些抗原基因是通过何种机制诱发肿瘤患者产生自身抗体，它们又是如何参与结肠癌的发生开展的呢？这仍需一步的研究。肿瘤自身抗体谱作为肿瘤血清诊断的新型标志物的应用前景和价值已逐渐被学界认可，这一领域的研究已逐渐成为肿瘤血清诊断的新型标志物研究的热点。2022年，ang等8报道他们通过类似的方法得到的22个前列腺癌抗原对于前列腺癌的诊断的敏感性到达了81.6%，特异性到达了88.2%，明显高于psa诊断的结果。他们的这一研究被新英格兰医学杂志评为近年来分子诊断标志物的最重要的进展9。2022年的一项最新研究报道也显示，蛋白芯片检测自身抗体谱技术可以提早于临床诊断5年发现约80%的处于“癌前阶段的患者，证明该技术在癌前病变的筛查中也具有非常重要的作用10。本研究对新发现4个结肠癌自身抗体作为结肠癌血清标志物的潜能进展了研究。结果发现：1、29、21在正常人血清中抗体阳性率较低，均小于23%，而在结肠癌病人血清中抗体阳性率较高，均大于77%,2检验结果显示有显著性差异p0.01。应用多个分子标志物结合诊断肿瘤已经成为学界共识。我们应用这三个标志物结合分析也明显地进步了诊断的敏感性和特异性，说明其可以成为结肠癌早期诊断的血清学标