DNA的提取与鉴定

1、一、目的随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常 需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实 验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握CTAB提取 DNA的方法，进一步了解DNA的性质。二、原理细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细 胞核内。提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋 白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大, 利用这一特性可将二者分离。以

2、NaCl溶液为例：RNP在0.14mol/LNaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%。当 NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不 断增加。当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍, 因此通常可用1.4mol/L NaCl提取DNA。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。关于植物总DNA的提取主要有两种方法：CTAB 法：CTAB （十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide,简称 CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶

3、解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在 高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程 度（0.3 mol/LNaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同 蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀， CTAB能溶解于乙醇中。SDS 法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS （十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate,简称 SDS）使 DNA与蛋白质分离，在高温（5565C ）条件下裂解细胞，使染色体离 析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使 蛋白质及多糖杂质沉淀

4、，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽 提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA为107109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA的 分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致 酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因 此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质(如多酚、类黄酮等)、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase对 DNA的降解。(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现(

5、1)尽量去除蛋白质的要求， 需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较 低温度下进行(一般利用液氮或冰浴)。为实现(2)需要在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行 DNA溶液转移时用大口(或剪口)吸管。提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学 测定、“熔点(mel ting tempera tu re,Tm)测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB法 提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。三、实验材料、主要仪器和试剂实验材料新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等主要仪器高速冷冻离心机751型分光光度计

6、恒温水浴液氮或冰浴设备磨口锥形瓶核酸电泳设备试剂(CTAB法)CTAB 提取缓冲液：100mmol/LTris-HCl (pH8.0)，20 mmol/L EDTA-Na2, 1.4mol/LNaCl (如表 1)，2% CTAB，使用前加入 0.1%(V/V) 的 0-巯基乙醇。表1 CTAB提取缓冲液配制用HCl调pH值。TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA ( pH8.0)。DNase-free RNase A:溶解 RNase A 于 TE 缓冲液中，浓度 为 10mg/mL，煮沸 1030min,除去 DNase活性，一20C贮存(DNase 为 DN

7、A 酶，Rnase 为 RNA 酶)。氯仿-异戊醇混合液(24:1，V/V)： 240mL氯仿(A.R.)加 10mL异戊醇(A.R.)混匀。3mol/L 乙酸钠(NaAc，pH6.8):称取 NaAc 3H20 81.62g， 用蒸馏水溶解，配制成200mL，用HAc调pH至6.5。95%乙醇TE缓冲液，Tris-HCl (pH8.0)液，NaAc溶液均需要高压灭菌。四、操作步骤称取25g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自 来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，加入15mL 预热(6065C )的 C

8、TAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65C水浴保温，0.5lh, 不时地轻轻摇动混匀。2加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳 状液。3将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4 OOOr/min离心 5min，静置，离心管中出现3层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞 碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。4根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。5收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入12 倍体积预冷的95%乙醇，边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到 纤维状的沉淀(主要为DNA)迅速缠绕在玻棒上。小心取下这些纤维状 沉淀，加12 mL

9、70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它杂质。若要制取较纯 的DNA，可将粗制品溶于TE缓冲液中，加入10mg/mL的RNase溶液，使其终浓度达50p g/mL，混合物于37C水浴中保温30min除 去RNA。重复步骤25的操作，可制得较纯的DNA制品。将DNA制品溶于250L的TE缓冲液中，完全溶解DNA样品。加入1/10倍体积的3mol/L NaAc (pH6.8)和2倍体积的95% 乙醇，沉淀DNA，重复步骤5。最后，将DNA溶于250L的TE缓冲液中。在751型分光光度计上测定该溶液在260nm紫外光波长下的光 密度值。代入

10、下式计算DNA的含量。四、结果计算式中OD260nm为260nm处的光密度；L为比色杯光径(cm) ； 0.020 为1g/mL DNA钠盐的光密度。DNA的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外 吸收高峰为280nm。上述DNA溶液适当稀释后，在751分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm和OD280nm。如OD260nm/ 0D230nm$20D260nm/ 0D280nm$1.8，表示 RNA已经除净，蛋白含量不超过0.3%。五、附注如果植物样品不经液氮处理，提取液中的CTAB浓度需要提高到4% (W/V)。在许多情况下，使用0.1% (V/V)巯基 乙

11、醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧化作用不会影 响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1% (V/V)， 则会大大降低DNA的得率。六、思考题制备的DNA在什么溶液中较稳定？为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？参考答案制备的DNA在：(1)含有螯和剂如EDTA中较稳定，因为EDTA 能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase；(2)在pH59之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA的结构；(3)有一定离子强度(强度越高，DNA越稳定)的溶液中较稳定。(TE满足以上要求，但如需对所得DNA进行酶切，EDTA浓度不可 过高，一般用 0.1XTE

12、或 0.2XTE)。为了保证植物DNA的完整性：(1)整个提取过程应在较低温度 下进行(一般利用液氮或冰浴);这样可防止和抑制内源DNase对DNA的 降解；(2)当DNA处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行DNA 溶液转移时用大口(或剪口)吸管，尽量减少对溶液中DNA的机械剪切 破坏。#日志日期：2008-7-14星期一(Monday)晴 复制链接 举报新天涯，新体验，2012新版即将内测！评论人：vivoGo 评论日期：2008-7-14 20:331)小量：植株的绿叶或花等组织适量，置于1.5ml的离心管中，用小棒 研磨成浆(在液氮中)，加350ul裂解液，冲洗小棒。大量：收集大量的植物组织，用液氮速冻后在研钵中充分研碎，然后将 植物组织粉末分装到1.5ml的离心管中，再在每管中加入400 ul裂解液。加600ul的酚-氯仿，剧烈震荡，使蛋白质变性。12000rpm离心2分钟后取上清。加 50ul 3M NaAc(PH5.2),600ul 异丙醇，混匀，-20C 放置 20min 以上，12000rpm离心5分钟。弃上清，用70%乙醇洗沉淀一次，12000rpm离心5分钟。弃上清，烘干，加2050ul水。(一操作至此，如PCR实验。高质量的DNA的获取可以用以下步骤纯