重组结核分枝杆菌Mr 38 000蛋白的表达、纯化和鉴定

1、重组结核分枝杆菌Mr 38 000蛋白的表达、纯化和鉴定摘要从h37rv基因组中扩增r38000蛋白基因并高效表达和纯化。用pr技术从结核分枝杆菌h37rv基因组中扩增r38000蛋白序列，将其与pge-t-easy载体连接转化e.lidh5，构建重组克隆载体pge-t-easy/r38000，测序正确后将目的基因片断克隆入pqe-80l原核表达载体并转化e.lidh5，iptg诱导目的蛋白表达。经estern-blt鉴定目的基因与(his)6交融表达，将已表达的蛋白质通过ni-nta亲和色谱柱进展纯化。pr得到结核分枝杆菌r38000蛋白基因，测序结果与gebank中报道的完全一致。sds显

2、示，在r为38.5103处有相应的蛋白质表达条带，esernblt鉴定为(his)6交融表达蛋白。经ni-nta亲和色谱柱进展纯化后可得到纯化的蛋白。成功克隆了铁调节蛋白基因r38000蛋白序列，并在e.lidh5高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白。关键词r38000蛋白;表达;纯化;结核分枝杆菌；lning,expressinandpurifiatinfr38000prteinfrybateriutuberulsiszhanging，lijin-heng，linhangkeyrdsr38000prtein;expressin;purifiatin;ybateriutuberulsis(t

3、b)结核分枝杆菌ybateriutuberulsis,tb是结核病(tuberulsis,tb)的病原体。其在患者体内主要为细胞内生长。诊断方法的欠缺是结核病流行的重要原因。目前常用的ppd试验，常使bg疫苗接种者被误检为阳性1，且对后期结核患者敏感性较低，存在明显缺乏。近年来，有研究发现r38000蛋白具有强的免疫原性，而成为结核分枝杆菌抗原的研究热点2,3，可能成为结核病血清学诊断试剂和疫苗研究的候选抗原之一。为此，我们在原核表达载体中表达结核分枝杆菌r38000蛋白并对其进展了纯化，为进一步研究其抗原性和主要功能提供方便。材料和方法1.1材料tb毒株h37rv、dh5由本室保存;pge-

4、t-easy及izardpluspurifiatinsyste购自prega公司；x-gal，限制性内切酶bah,er及t4-dna连接酶，taqdna聚合酶均为takara公司产品；iptg,dtt,dte,小量质粒提取试剂盒均为siga公司产品，胶回收试剂盒为vitagene公司产品。1.2方法参加er酶切位点。引物由上海生工生物技术合成。改良罗氏培养基的tbh37rv接种于7h9液体培养基，37间或振荡培养23k。取5l液体培养物的菌体沉淀重悬于50l裂解液中。于55水浴1h，沸水浴10in灭活蛋白酶k，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50lte中，作为dna模板。pr反响

5、体系为：10buffer5l,dntps5l(2.5l/l)、dna模板为1l，p1，p2引物各1l(25l/l)及taq酶1l，加水至50l。pr条件：94变性40s，60复性30s，72延伸1.5in，30个循环。反响，转化感受态dh5，均匀涂布于含有x-gal(33l)和异丙基-d硫代半乳糖苷iptg(20l)的lb培养皿中，37培养16h，挑取白色菌落进展酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pge-t-easy-r38000，送至上海生工生物工程进展序列测定。反响，转化感受态dh5，挑取的阳性克隆命名为pqe-80l-r38000。在含有氨苄青霉素100g/l的lb培养基中过夜培养pqe-80

6、l-r38000。按10%的接种量进展转接，37摇菌3h，参加异丙基-d硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.5l/l，37继续培养45h。取1.5l细菌培养物，8000g离心30s搜集菌体，参加2样品缓冲液剧烈振荡混匀，100,5in；8000g离心5in；取上清进展sds电泳检测。参加hrp标记的羊抗鼠igg抗体，37孵育1h。pbs洗涤后dab显色观察结果。2结果2.1r38000蛋白片段的扩增及序列测定经30个循环pr扩增，可得与预计长度相等的片断图1。将dna回收后插入pge-t-easy载体，经测序证实所扩增的r38000序列与gebank数据库所收录的r38000序列完全一致。:

7、dnaarkerdl2000;1:r38000基因pr产物;图1pr扩增r38000蛋白基因产物琼脂糖凝胶电泳10g/l结果2.2表达载体的构建pqe-80l经bahi和er双酶切后与r38000基因目的片断进展连接反响后，转化感受态e.lidh5。挑取的克隆子进展酶切鉴定，切出约1151bp大小片段的为阳性克隆子(图2)，命名为pqe-80l-r38000。:dnaarkerdl2000;1,2:pqe-80lr38000;图2pqe-80l-r38000重组质粒bahi和er双酶切鉴定结果2.3r38000蛋白在pqe-80l表达载体中的诱导表达将pqe-80l-r38000经37活化过夜

8、，经iptg诱导表达后做sds分析，从电泳图中可以看出在r为38.5103一致处出现了一条表达带，表达量约占菌体总蛋白的20%(图3)。：蛋白分子量arker;1:未诱导的pqe-80l-r38000质量重组菌e.lidh5;2-4:诱导的pqe-80l-r38000质量重组菌e.lidh5;图3(his)6-r38000交融蛋白的sds分析2.4目的蛋白的鉴定所构建的重组质粒表达的r38000蛋白以带有6个组氨酸的交融蛋白的形式出现，使用鼠抗(his)6ab验证r38000蛋白的表达。结果显示在r为38.5103处有一显色带，而对照无相应条带(图4)。：蛋白分子量arker;1:(his)6

9、-r38000prteinexpressin2.dh5图4(his)6-r38000交融蛋白的esternblt分析结果2.5目的蛋白的可溶性分析将上清和沉淀分别所制样品，进展sds分析说明表达产物主要在细菌裂解后的沉淀中，而上清中那么很少(图5)。：蛋白分子量arker;1:未诱导的pqe-80l-r38000质量重组菌e.lidh5；2：诱导菌超声裂解后沉淀;3:诱导菌超声裂解后上清;图5(his)6-r38000交融蛋白的可溶性分析2.6目的蛋白的纯化纯化的产物经sds分析可在r为38.5103处得到一条明晰的条带(图6)。：蛋白分子量arker;1:未诱导的pqe-80l-r38000

10、质量重组菌e.lidh5;2:诱导的pqe-80l-r38000质量重组菌e.lidh5;3,4:(his)6-r38000纯化蛋白图6(his)6-r38000交融蛋白的表达及纯化3讨论r38000蛋白是一种磷酸盐转运蛋白，含有对结核分枝杆菌特异单克隆抗体定位的7个表位，具有较强的抗原性，已经得到了结核病研究学者们的一致认可。1992年，bthaley4等认为r38000蛋白是研究菌阴性肺结核最有用的抗原之一。2022年ark5等通过蛋白质基因芯片和病人血清挑选，发现r38000蛋白是空洞性肺结核所特有的蛋白抗原。本实验中应用的pqe-80l表达载体为4751bp，起始码下游接有6个组氨酸，

11、双链环状，ap抗性，多克隆位点有17个单一限制性酶切位点。pr产物共有约1150bp，与r38000蛋白基因大小相符合。r38000克隆入pqe-80l载体中与6个组氨酸交融，可产生共约390个氨基酸的交融蛋白，r为38.5103左右，实验结果与理论值相符合。交融蛋白有(his)6的表达，因此通过检测组氨酸的表达，可间接证明r38000蛋白表达，同时(his)6的表达为进一步纯化蛋白提供了亲和位点，它可与ni+特异性结合，通过ni-nta亲和色谱柱可得到纯化的目的蛋白。我们在原核表达系统中成功表达结核分枝杆菌的r38000蛋白，并进展了初步鉴定和纯化，为下一步深化研究r38000蛋白的功能奠定

12、了基矗参考文献1brittnj,palengira.iprvingvainesagainsttuberulsisj.iunalellbil,2022:81(1):3445.2rldhealthrganizatinglbaltuberulsisntrl-surveillane,planning,finaning,hrept2022,rldhealthriganizatin,gengeva.3laals,skeikyya.iune-basedethds,intuberulsisandthetuberlebaillusj.aeriansietyfrirbilgypress,ashingtn,d.2022,7183.4bthaleygh,rrudd,ffestenstein.linialvalueftheeasureentfybateriutuberusisspeifiantibdyinpulnarytuberulsis