自闭症儿童大脑新皮质裂解斑块

1、干刊名： The New England journal of medicine影响因子：54.42出版年：2014题目： Patches of Disorganization in the Neocortex of Children with Autism自闭症儿童的新皮质上的裂解斑块摘要背景：自闭症包括大脑早期的过度发育和功能障碍，尤其在额叶前部的皮质表达更明显。一个 病理学分析估计，自闭症儿童额叶前部皮质的过量神经元发射信号干扰出生前的发育，并且 伴发异常的细胞型和板状发育。方法：为了在自闭症发作后的早些年系统的检查大脑的新皮层的结构，我们应用特异细胞型分 子作为标记物的RNA原位杂交技

2、术来显示皮质的微细结构。我们分析神经元和神经胶质的 标记物，还有那些被自闭症牵涉的，额叶前部的、颞部的基因，还有枕部的大脑的新皮层的 组织。这些样本来自患有自闭症的和未患有自闭症的2到15岁的儿童死后。结果：我们在额叶前部和颞部皮质组织观察到异常的板状的细胞结构的局部斑块和神经皮质 的裂解，但不是神经胶质，这出现在10/11的自闭症儿童和1/11的非自闭症儿童中。在考虑 到斑块是最不正常的细胞型，和板层很可能受病理特征影响时，我们观察到了他们之间的特 异性。从第4、5层的异常表达的清晰的标记可以看出，没有皮质层多余。皮层标记物的三 维重建证实了板块的局部位置和大小。结论：在这个小的探索性的研究

3、中，我们发现大多数年轻的自闭症儿童有板状皮质结构的局部 断裂。我们的数据支持，可能是在出生前的发育阶段的层状结构调节异常和特异层状神经元 变异。在一定程度上，自闭症是可遗传的发育紊乱，大多数病人包括肉眼可见的早期大脑过度 发育和功能紊乱，影响皮质和皮质下区域的自我调节中心，包括额叶前部和颞部的皮质。潜 在的皮质缺陷的仍然不能确定。不管早期可诊断的发作，有超过40个研究表明，尸检分析 自闭症患者的平均年龄是22岁。先前的三个研究评估4到60岁自闭症患者的大脑尼斯尔染色切片，描述个体异位图例， 轻微的局部板层状裂解，室管膜下的发育不良，但是没有报道共同的神经病理学缺陷。然而， 观察年轻的成年人，自

4、闭症人的大脑不在扩大，取而代之的是皮质的变薄和神经元的丢失， 这表明包含成人的自闭症的研究可能不会揭示出神经系统发育畸形，而这在自闭症儿童的大 脑中存在。自闭症儿童大脑的分子、细胞还有组织的异常还有很多没有被研究，早期的大脑 的增大和功能障碍的基础仍然是推理的。最近，我们发现年轻的自闭症儿童的基因和基因路径的异常表达受细胞周期调节、DNA 的完整性、细胞的分化、额叶前部的皮质的发育来控制。我们同样发现，和未患自闭症的儿 童比，在2到16岁的自闭症儿童之间，他们有异常重的大脑，并且额叶前部皮质的神经元 数量增加了 67%。尽管皮质神经的暂时性增加期望在怀孕的第3到6个月，但是这种增加 通常在出生

5、后或出生后的几个内消失，在这期间皮质的板层状发展和皮质-皮质下电通路会 发育成熟。尽管引起自闭症患者神经元数量增多的原因仍然不明确，但是这种异常出现在出 生前，而且期望能在早期皮质发育过程阻断它，就像阻断其他的已经确定的紊乱一样，例如 无脑回，多小脑回，脑裂还有皮质异位这些由细胞周期进程、神经元异位、消减和凋亡缺陷 引起的紊乱。正如前人的研究的报告那样，应用MRI，功能MRI，基因表达，和神经元计 数，我们猜测自闭症儿童的新皮质存在干扰，并且在额叶前部和颞部的皮质可以探测到。 为了验证这个假说，我们应用标准比色RNA原位杂交技术系统的检查一大组高度选择性的 分子标记物的表达，尸检标本来自患自闭

6、症的儿童和非患自闭症的儿童。这些标记物包括刺 激剂亚型、抑制神经元、小神经胶质细胞、星型神经胶质和一组自闭症候选者基因。方法标记物选择应用原位杂交技术，我们分析了 63号基因的表达模式，包括背外侧额叶前部皮质的皮 质特殊层状标记物，自闭症涉及的基因，假定的细胞类型标记物。这些样本来自2名未感染 自闭症儿童，他们分别10岁和16岁。在分析结果的基础上，我们选择25个63号基因来进 一步研究自闭症儿童，因为这些基因在皮质有稳健的协调的特异的表达模式。最终设置的 25个标记物包括探针，可选择标记一个或多个皮层，或标记一个或多个特异性细胞型组。获得尸检组织我们从儿童的背外侧额部前叶皮质上部的或中间的额

7、部脑回，后上部颞部皮质或枕部皮 质得到的42个新鲜冰冻尸检皮质组织切片，这些儿童2到15岁，患有自闭症或没有患自闭 症（控制组）。实验组或对照组的特殊临床表型没有前置选择。选择样本能代表适合研究的整 体组织，来自儿童健康和人类发展国际组织的脑组织发育紊乱组，哈佛脑组织资源中心。样 本通过了质量控制，包括22块背外侧的额叶前部皮质，5块后上部颞部皮质，6块枕部皮质。标记物表型研究1每个背外侧额叶前部皮质做连续冰冻切片（20微米厚），包含所有的板层。这些切片被 分为10组，每组30张切片；24张切片杂交技术做标记，2张用尼斯尔染色来观察解剖学结 构和细胞结构分析，还有4张未作处理留在将来用。我们修

8、改实验方法来实现原位杂交技术 自动高流量输出并获得处理尸检样本全部载玻片的数字图像，这些样本来自年轻人出生后的 新鲜的冰冻脑组织。研究2我们连续切每个标本块并用原位杂交来标记3个背外侧的额叶前部皮质的标本和3个来 自女孩的对照标本和来自男孩的颞部皮质标本（2个实验组、3个对照组）和来自男孩的枕 部皮质标本（3个实验组、3个对照组）来分析5个基因的表达:CALB1，RORB,PCP4，PDE1A, 和NEFL。这些基因代表基因的一个亚类，实验1中经过分析发现在男孩的样本中表现出强 大的变异。评估标记物的表达我们给通过原位杂交获得的每个样本基因所有数据进行评分：0分正常，1分轻微异常， 2分严重异

9、常。如果我们确定3张切片至少符合如下三个标准之一的就认为是异常的：和对 照组相比，基因表达的强度显示减少或断裂；和邻近区域的数量比，在标记的细胞数量中基 因表达异常归因于质量的改变；或者和对照组比，基因表达的特殊细胞型或层出现异常。同 一个研究人员检查对每个标本的每个切片进行评分，另一个研究人员在另一个地方独自对每 个切片进行观察和积分，他对第一个研究人员的计分毫不知情。然后比较这两组计分，比较 它们的一致性。叠加表达和三维重建为了使基因中异常表达配准区域成像，运用PhotoshopCS5（Adobe系统）软件的多彩 叠加，通过手动调节调整来记录和混合一系列原位杂交图片。制作原位杂交的每张图的

10、虚假 表达密度表征，并且对齐形成一个插入图册。这些图册纳入分子可视工具来捕捉皮质层切片 的完全三维显微结构。结果表达分析为了提供自闭症儿童皮质疾病的最初的描述，我们进行了原位表达分析，运用大范围区 域系统抽样背外侧额叶前部皮质、后上部颞部皮质，还有枕部皮质进行探索性实验，样本包 括自闭症儿童和非自闭症儿童。对照组的层状表达剖面图未患病儿童的11个样本中检测到层状表达模式，这和先前研究的未患病成人的结果类 似，其中一例除外。一个9岁未患病女孩的标本显示了一个局部异常点：在背外侧额叶前部 皮质的第3、4、5层出现一个长6毫米的缺乏符合标记物标记的斑块样区域。异常层状表达模式经不同的评定者鉴定，10

11、/11的局部区域出现表达减少或原位杂交的标记物的不正常模 式。这些称作为斑块的不正常区域，在一个或多个独立的标记物中长5到7毫米，有明显的 边界。异常标签的描述扩展到多个切片，而且经常包括一个细胞亚型标记物的局部的表达减 少。从11个自闭症儿童的其中3个，我们观察到包括标记的细胞密度增加的区域和斑块区 域邻近。我们发现大多数斑块的4、5层有特殊标记物。但是，没有那两个斑块的表象完全一样 的。一个标本中的斑块有相似的标记模式。考虑到样本的层和细胞型非常异常，我们观测到 了异质性。一个9岁自闭症儿童的标本清晰地显示斑块的表现型，通过对一个直径5.8毫米 的皮质斑块进行多重独立标记物时，发现它的表达

12、减少。在两侧背外侧额叶前部皮质和后上颞部皮质都有斑块。3个样本的枕部皮质或3个对照 组组的后上颞部皮质或或枕部皮质都没有异常的表达模式。层状缺陷的三维重建为了更好的描述斑块显型的完整显微结构，我们对斑块区域的层状区域进行了三维重 建，并对4个背外侧额叶前部皮质的样本用了 4种不同的标记物。这个方法使原始切片的平 面独立分布的标记物分布可视，并且确定有多个标记物斑块区域紧挨着对齐。图3显示了一 个自闭症儿童皮质的表层重建，显示一个显著的病理学斑块穿过多层独立的标记物，和标准 的皮质有显著界限。斑块区域的标记物表达兴奋皮质神经元标记物的表达的缺陷是斑块区域最有效的指示物，尽管在四个细胞特异 型组中

13、有三个已经被确认为异常情况。标记物由5个自闭症候选基因编码，和大多数检验过 的样本比，这些基因显示轻微的斑块异常。大多数中间神经元显示轻微的异常，这在实验组 样本中存在不一致，也有少数例外，相对出现在未患自闭症组的分析中。有一个例外（12号病人的SLC1A2），特异性胶质标记物在实验组和对照组不同的皮质 区域显示相同的标记模式，包括在用其他标记物的异常斑块中。这个发现支持了斑块的特征 不属于主要的基因表达的减量调节的假设。神经元的密度没有减少为了确定多基因异常表达是否由于分散区域的神经元的数量的减少，我们在病人死后用 无目的的使用尼氏染色切片相邻的呈现在背外侧前额叶皮层斑块部分进行体视密度测量

14、。我 们最少通过5个尼氏切片测量每个样本的两个区域的全部的板层神经元和神经胶质的密度， 这些切片最少包括3毫米的皮质。我们观察到很小但很有意义的是和对照组相比，斑块区域 的平均神经元密度有增大（P=0.01）。实验组中，和邻近区域比较，斑块区域的平均神经元 密度增大，但是没有统计学意义（P=0.10）。在这些结果的基础上，我们推断，局部斑块区 域并不是神经元数量减少的结果。检查结果的定量验证我们进行定量的RT-PCR分析来验证原位杂交半定量检查结果。从用来研究的第4组有 最严重斑块的样本中检查出来额外的组织块。在这些样本中，我们进一步确定了一个严重的 斑块和一个轻微的斑块。重点是严重斑块的那一

15、组，我们通过原位杂交指导用激光捕捉显微 解剖来分离斑块和邻近感兴趣区域，并用PT-PCR分析CALB1的信使RNA的转录水平。 和原位杂交得到的结果一致的是，我们观察到和邻近区域相比，孤立斑块的C ALB1信号显 著减少。讨论为特殊细胞亚型和自闭症候选基因亚型用大量高选择性的标记物，我们检测到不连续的 异常层状细胞结构的病理学斑块，在额叶前部和颞部的皮质大量分析样本中发现有裂解，但 是枕部的皮质没有发现，样本来自我们研究涉及的患有自闭症的男孩和女孩。连续的分析和 多重细胞标记物的三维重建显示，这些基因异常表达的局部斑块长5到7毫米，并跨过多重 连续的大脑新皮质层。这些斑块有一下特征：细胞表达层

16、数目减少，特异细胞型标记物在完 全分化的皮质神经元中正常存在，某些自闭症候选基因的表达减少。样本中斑块的显示是一致的，但在整个样本中有是不一样的。没有皮质层均匀的多余， 异常表达的明显的证据在第4、5层。标记物表达减少不是因为神经元数量的减少；斑块中 未标记神经元的身份任然不能确定。这些神经元可能是没有表达标记物的层合适神经元，或 是处在幼稚或扰乱发育的状态的神经元，或者是层不适合神经元。我们的数据和早期出生前 起源或至少出生前发展的，可以认为有自闭症倾向的数据一致。尽管我们的数据提出了一个新奇的自闭症的病理学机制，但是他们不能鉴别这个机制。 被鉴定的层状裂解可能由于细胞未能达到特定的目的地产

17、生的移动缺陷和邻近区域的细胞 的积累造成的，如已经在小鼠迁移模型中看到的那样。或者，斑块可以反应早期神经发育过 程中潜在的基因序列和表观遗传状态从头到尾的变化，这些产量斑块区域邻近未受影响的祖 细胞区域的受影响的祖细胞。为了检验任意一个模型，需要来自自闭症儿童的大脑新皮质组 织大区域的定量分析，来详细的比较基因序列，甲基化状态和皮质斑块确定区域的表达剖面 图，和没有斑块的区域作比较。尽管我们没有预选特殊的临床表型，但是我们在10/11的样本中和1/11的对照组中确定 了病理学皮质斑块。因为我们的每个样本几乎都是观察到的局部斑块的一小部分，最牵强的 解释是病理学斑块广泛分布在自闭症儿童的额叶前部

18、皮质和颞部皮质。鉴于自闭症中很好描 述的表现型异质性，样本中相对相似的病理学特征的存在也是不希望看到的。然而，我们描 述的特征可能解释一些自闭症的特异性表现型:额叶前部和颞部皮质的不同部位的破裂的斑 块能中段不平等的功能系统，并潜在的影响症状的表达、治疗的反应和临床结果。从这个模 型中对照组中相似斑块的观察结果同样升高了亚临床斑块表现型的可能性。我们没有观察到斑块中标记物表达明显的异常，小神经胶质细胞和星型神经胶质一样， 结果表明原位信号的缺乏不是非特异性组织或通常情况下影响信使RNA的完整性的处理的 人工制品。原位杂交指导的特殊RT-PCR实验进一步确认我们最初方发现的在信号方面而不 是处理过程的伪迹上斑块区域定量的减少。这里用的原位杂交的标准化的高流通量的色度法的强度是通过大的基因组的标签的再 现性和标记连续薄的切片的表达细胞胞体的方法的敏感性。这种方法广泛应用在大鼠大脑基 因转录物分布的全基因组测绘，而且定向分析非人类的灵长类动物的大脑组织。我们的实验 设计由