淫羊藿苷干预关节软骨细胞对NF-κB信号通路表达的影响课件

1、淫羊藿苷干预关节软骨细胞对NF-B信号通路表达的影响南京市中医院骨伤科 钱卫庆 立项依据：国内外研究现状及发展动态分析 骨关节炎是一个世界性骨骼健康问题，严重影响老年人寿命和生活质量，目前研究的重心主要基于分析蛋白酶对软骨细胞凋亡及软骨细胞外基质降解的作用方面。其中对于淫羊藿苷抑制软骨破坏，发挥软骨保护的作用已被广泛认可。立项依据：课题组相关研究概况我科前期在江苏省中医药局科技项目及南京市医学科技发展项目的资助下我们就淫羊藿苷促成骨形成机制方面进行了相关的动物及蛋白组学方面的研究，并圆满结题。我科近年来开始就淫羊藿苷对于软骨细胞保护的机理方面开展探索工作。立项依据：前期研究及相关文献查阅1.在

2、呼吸系统方面、心血管疾病方面，已有大量试验发现淫羊藿苷可以抑制NF-B通路的活化，达到抑制炎性细胞因子表达的作用 1-22.在骨科疾病方面，大量研究证实NF-B信号通路与OA形成与发展具有密切的联系。 NF-B首先是由于细胞外刺激，通过细胞内的级联反应，最终导致软骨降解和关节损伤 33.穿心莲内酯能够通过抑制 NF-B 信号通路的激活，显著地下调 IL-1 刺激人关节软骨细胞，降低MMP-3/13 等多种炎性介质的表达4 1 杜文静；补肾中药组分淫羊蕾昔对哮喘小鼠嗜酸粒细胞凋亡的影响d;复旦大学;2011年 2CHEN SR，XU XZ，WANG YH，et al Icariin Deriva

3、tive Inhibits Inflammation through Suppression of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase and Nuclear Factor-B PathwaysJ Biol Pharm Bull，2010，33( 8) :1307-1313 3. 周庄，张柳等NF-B信号通路在骨性关节炎发生发展中作用机制的研究J中国骨质疏松杂志，2012，18( 1) : 78 82 4. Ding QH,JiXW,Cheng Y,et al.inhibition of matrux metalloprteinases and induc

4、ible nitric oxide synthase by andrographolide in human osteoarthritic chondrocytesJ.modRheumatol,2012 Dec 15.立项依据：前期研究及相关文献查阅4. uPA系统是NF-B的下游调控因子，NF-KB在炎症过程中被激活后,进入细胞核内发挥转录活性, 可上调uPA的表达55. uPA和uPAR（uPA受体）在关节软骨病变的表层表达最为强烈, 并且 uPA和uPAR 的水平与关节软骨破坏的严重程度呈正相关性 65. MarcuKB，OteroM，OlivottoE，NF一kappaB signal

5、ing:multiple angles to target OA. Curr Drug Targets，2010,11(5): 599一613. 6. 张立智，张先龙，王琦，等 骨关节炎软骨下骨的成骨细胞生物学表型研究J 第三军医大学学报，2011，33( 10) : 1003 1007假设：淫羊藿苷干预软骨细胞的过程中，淫羊藿苷是否也可以通过抑制NF-B通路的活化，抑制炎性细胞因子表达，从而达到保护软骨细胞作用？同时，在抑制NF-B通路的活化后，是否对下游调控因子uPA系统产生影响，而进一步达到抑制蛋白酶对软骨细胞外基质的降解，起到保护关节软骨的作用？立项依据：本课题科研假设立项依据：前期研

6、究工作基础我们之前在淫羊藿苷对大鼠成骨细胞蛋白质组学影响的研究中发现10ng.ml-1 浓度的淫羊藿苷能快速促进SD大鼠成骨细胞的增殖和分化7。7.钱卫庆，尹宏，孙海涛。不同浓度淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响,中国医药导报2011,36:23-25。研究方案：实验分组及干预原代成骨细胞传代24小时后分为5组: (1) 空白组: 10%IMDM正常培养;(2) PDTC组：加入0.5mmol/LNF-B阻滞剂PDTC (3) 淫羊藿低剂量组:加入0.1mg/mL淫羊藿苷 (4) 淫羊藿中剂量组:加入1mg/mL淫羊藿苷(5) 淫羊藿高剂量组:加入10/mL淫羊藿苷以每孔 1 106个细胞

7、的密度接种软骨细胞于6孔板，培养 2 h 后，除空白组外均以IL110 gL 1刺激 1 h研究方案：软骨细胞培养及鉴定 2 周龄新西兰白兔 3 只，处死，75% 乙醇浸泡; 剪取股骨头、膝关节、肩关节、肋骨以及剑突处软骨组织，采用酶消化法原代培养兔软骨细胞。型胶原免疫组化染色法兔对软骨细胞进行鉴定 研究方案：淫羊藿苷对NF-B信号通路表达的影响检测采用RT-PCR 法检测MMp3/13 ，uPA，NF-B mRNA 含量 。采用Western blot法检测 IB（NF-B的抑制蛋白） 、PAI（uPA抑制物）、uPAR （uPA受体）蛋白水平 凝胶阻滞分析实验检测 NF-B与 DNA 的结

8、合活性 。研究方案：技术路线兔软骨细胞的体外培养和细胞活性的鉴定判断淫羊藿苷对软骨细胞损伤的保护与治疗用10 gL 1 的IL一l作用于关节软骨细胞正常空白组淫羊藿苷低剂量组:加入0.1mg/mL淫羊藿苷淫羊藿苷中剂量组:加入1mg/mL淫羊藿苷淫羊藿苷高剂量组:加入10/mL淫羊藿苷real一 timePCR技术检测MMp3/13 mRNA、uPA mRNA、NF-kb mRNAPDTC组（NF-B阻滞剂）Westen检测磷酸化的I-B、PAIEMSA检测NF-B与DNA的结合本项目的特色与创新1.淫羊藿苷对骨关节炎软骨细胞NF-KB信号转导途径及其下游的调控因子uPA系统的影响，目前国内外

9、尚未见报道。2.本科题首次在细胞分子水平上观察淫羊藿苷对白介素IL1(IL1)诱导下兔软骨细胞 NF-KB信号通路及uPA系统的影响，及何种浓度的淫羊藿苷的疗效最佳。前期研究：近期发表与本项目有关的论著1）钱卫庆，尹宏，口服与骨折局部应用淫羊藿对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响,中国中西医结合杂志2012年第06期：822-826。 2).尹宏，钱卫庆，磷酸钙骨水泥-淫羊藿复合材料促进骨质疏松大鼠骨折的愈合,中国组织工程研究2012年第16卷29期：5389-5395。3).尹宏，钱卫庆，淫羊藿对骨质疏松型骨折局部骨形成蛋白mRNA表达的影响, 中国骨质疏松杂志,2012年18第8期：717-720。 4).钱卫庆，尹宏，孙海涛，不同浓度淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响,中国医药导报2