内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中重组表达载体的构建-四川

1、PAGE PAGE 24内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中重组表达载体的构建生物科学 2003 级 廖俊华指导教师 陈 惠 教 授摘要：以生生物化学学与分子子生物学学实验室室克隆并并测序的的枯草芽芽孢杆菌菌C-336内切切葡聚糖糖酶基因因（Geenbaank 登录号号：DQQ78229544）为模模板，通通过PCCR将编编码信号号肽的序序列去除除，然后后与pMMD188-T Vecctorr克隆载载体连接接，构建pMDD18-T VVecttor亚亚克隆载载体。对pMDD18-T VVecttor质质粒先进进行Bggl单酶切切，回收收后再进进行Spph单酶切切，通过过两次单单酶切胶胶回收内内切葡

2、聚聚糖酶基基因（不不含信号号肽），并构建建巨大芽芽孢杆菌菌重组表达达载体pHECC-Ennd，将重组表表达载体体转化到到大肠杆杆菌DHH5中。通通过对转转化子进进行菌落落PCRR和质粒粒的酶切切检测证证明成功功构建了了内切葡葡聚糖酶酶的巨大大芽孢杆杆菌表达达载体。关键词：巨巨大芽孢孢杆菌，枯枯草芽孢孢杆菌， 内切葡葡聚糖酶酶 ，重重组表达达载体Consttrucctioon oof eeukaaryooticc Exxpreessiion Vecctorr off thee geene of enddogllucaanasse iin BBaciilluus MMegaaterriummLIA

3、O Junn-huua Biollogiicall Scciennce, Grradee 20003Direcctedd byy CChenn Huui( Proof)Abstrractt: By thee waay oof PPCR, thhe ssequuencce ccomiing froom eendoogluucannasee geene (Geenbaank No. DQQ78229544 ) in B.ssubttiliis CC-366 sttraiin aand coddingg foor tthe siggnall peeptiide of enddogllucaanass

4、e wwas remmoveed.TThe enddogllucaanasse ggenee waas cclonned andd seequeenceed iin tthe Labboraatorry oof BBiocchemmisttry andd Moolecculaar Bioologgy.TThenn thhe ggenee wiithoout thee siignaal ppepttidee seequeencee waas lligaatedd wiith thee cllonee pllasmmid pMDD18-T.Thee pMMD188-T Vecctorr waas

5、cconsstruucteed. Firrst, thhe ppasmmid wass cuutedd byy Bggl.Theen,thee paasmiid wwas cutted by Sphh.By doubble enzyyme-cutt , thee geene of enddogllucaanasse iin BB.suubtiiliss C-36 strrainn wiithoout siggnall peeptiide wass reecivved. Thhe eeukaaryooticc exprresssionn vecctorr pHHEC-Endd wass coon

6、sttrucctedd.Eveentuuallly, thee euukarryottic exppresssioon vvecttor wass trranssforrmedd innto commpettentt E.colli DDH5 . By tthe wayy off coolonny PPCR andd reestrricttionn ennzymme ddigeestiing anaalyssis, thhe eeukaaryooticc exprresssionn vecttor of thee geene of enddogllucaanasse iin BBaciillu

7、us MMegaaterriumm waas consstruucteed ssucccesffullly.Keywoordss: Baccilllus Meggateeriuum，Baccilllus subbtillis，enddogllucaanasse，eukkaryyotiic eexprresssionn veectoor纤维素酶是是一类能能够降解解纤维素素，使之之生成纤纤维二糖糖、葡萄萄糖等一一系列酶酶的总称称，按各各酶功能能的不同同可以分分为内切切葡聚糖糖酶、外外切葡聚聚糖酶和和-葡萄萄糖苷酶酶三大类类1。纤维素素被它降降解后可可转化为为人类急急需的能能源、食食物、化化工原料料

8、，对于于人类社社会解决决食物短短缺和能能源危机机具有重重大的现现实意义义2。随着着中性纤纤维素酶酶和碱性性纤维素素酶在棉棉织品水水洗整理理工艺及及洗涤剂剂工业中中的成功功应用，细细菌纤维维素酶制制剂已显显示出良良好的使使用性能能和巨大大的经济济价值3。纤维素酶成成本高以以及酶活活力低已已成为制制约纤维维素酶广广泛应用用的两大大瓶颈，因因此，构构建高效效表达的的基因工工程菌是是降低纤纤维素酶酶成本、提提高产量量的有效效手段。几几乎所有有已克隆隆到的纤纤维素酶酶基因都都在大肠肠杆菌中中得到了了表达，但但是都几几乎存在在着表达达量低、分分离提纯纯困难的的缺陷。而而芽孢杆杆菌因具具有独特特的蛋白白分泌

9、系系统，使使得在表表达外源源蛋白的的宿主菌菌中深受受青睐。其中枯草芽孢杆菌是应用较广泛的一种外源蛋白表达系统，并且已用于商业化生产酶制剂，例如，Genecor 厂家就以该菌作为生产碱性蛋白酶的工程菌4。近年来，巨巨大芽孢孢杆菌也也在这方方面显示示出了较较好的应应用前景景，与枯枯草芽孢孢杆菌相相比，巨巨大芽孢孢杆菌还还具有两两大优点点：首先先是它不不具有碱碱性蛋白白酶，从从而使外外源蛋白白能很好好的表达达而不被被降解；再次是是重组质质粒能够够在宿主主菌中稳稳定存在在5。有很很多蛋白白已经成成功地在巨大大芽孢杆杆菌中得得到过量量表达，如如：Ryyguss和Hiilleen6（19991）在在巨大芽

10、芽孢杆菌菌中成功功地表达达了四种种外源蛋蛋白基因因，在木木糖操作作子的调调控下，这这些基因因的表达达提高1130到到3500倍不等等，且未未发现蛋蛋白酶水水解情况况。目前还未见见有关在在巨大芽芽孢杆菌菌中表达达内切葡葡聚糖酶酶的报道道，四川川农业大大学生物物化学实实验室通过过自行筛筛选得到到一株产产内切葡葡聚糖酶酶的枯草草芽孢杆杆菌并克克隆到了了编码该该酶的基基因（Gennbannk NNo. DQ77829954），拟在此此基础上上构建该该基因的的巨大芽芽孢杆菌菌表达载载体，实实现该基基因在巨巨大芽孢孢杆菌中中的分泌泌表达。本实验将不含信号肽枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因与巨大芽孢杆菌

11、表达载体pHIS1525进行连接，构建重组表达载体，使之能在表达载体自身信号肽的引导下进行融合表达，为进一步研究枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的高效表达及基因工程菌投入生产奠定基础。1 材料与与方法1.1 菌菌株及载载体：本工作所使使用的菌菌株和质质粒见表表1。表1 实验验所用的的菌株及及质粒Tab 11 Thhe sstraain andd pllasmmid useed iin tthe expperiimenntstraiin/pplassmiddCharaacteerissticcssourcceJM1099recA11 suupE444 eendAA1 hhsd

12、RR17 gyrrA966 reelA11 thhi(laac-pproAAB)FFStoreed iin tthiss laabDH5supE444laccU1669(80llacZZM155) rrecAA1Storeed iin tthiss laabpMD188-T VecctorrAmpr laccZTaKaRRa BBiottechhnollogyypHIS115255Tetr Amppr xxylRR PxxylAAMoBiTTecB3 pllasmmidpMD188-T Vecctorr inncluudinng tthe enddogllucaanasse ggenee Co

13、nsttrucctedd inn thhis labb1.2 分分子生物物学试剂剂：引物由上海海英俊生生物技术术有限公公司合成成；Bggl = 2 * ROMAN III、Sphh = 1 * ROMAN I、重组组Taqq DNNA PPolyymerrasee、dNNTP、TT4 DDNA Liggasee、pMDD18-T VVecttor购购自TaaKaRRa BBiottechhnollogyy；质粒粒提取试试剂盒、凝凝胶回收收试剂盒盒、DNNA MMarkker = 3 * ROMAN IIII、DNNA MMarkker = 7 * ROMAN VIII、DDNA/Hinnd =

14、 3 * ROMAN IIII购购自天为为时代；氨苄青青霉素购购自上海海生工。1.3 主主要药品品NaCl、胰胰蛋白胨胨、酵母母浸出粉粉、琼脂脂粉、琼琼脂糖、0.1mol/L CaCl2、甘油（终浓度为30%）。1.4 主主要仪器器：电热恒温培培养箱、HHZQ-F全温温振荡培培养箱、酸酸碱pHH计、TTGL-16GG台式普普通离心心机、板板式电泳泳槽、电电热恒温温水浴锅锅、PCCR仪、凝凝胶成像像仪等。1.5 培培养基、抗生素素贮存液液及琼脂糖糖电泳缓缓冲液：LB培养基基：1%胰蛋白白胨，11% NNaCll，0.5%酵酵母浸出出粉，ppH7.0（用用1mool/LL的NaaOH调调PH值值）

15、；配配制固体体培养基基时需加加入1.5%-2.00%的琼琼脂粉；配制抗抗生素培培养基时时需加入入氨苄青青霉素（终终浓度为为1000g/mL）。氨苄青霉素素（Ammp）贮贮存液7：1000gg/mLL（溶于于双蒸水水中），过过滤除菌菌，小份份分装（11mL/份）后后，-220保保存。琼脂糖电泳泳缓冲液液8：5TTBE贮贮存液：54gg Trris碱碱，277.5gg硼酸，220mLL 0.5mool/LL EDDTA（ppH8.0），溶溶于1LL去离子子水，用用时稀释释10倍倍。0.55moll/L EDTTA（ppH8.0）：将1886.11g二水水乙二胺胺四乙酸酸（EDDTA-Na.2H22

16、O）加加入8000mLL水中，用用磁力搅搅拌器剧剧烈搅拌拌，用NNaOHH调节ppH至88.0，定定容至11L。0.77%的琼琼脂糖凝凝胶：称称取0.7g琼琼脂糖于于1000 mLL 0.5TTBE中中，用微微波炉加加热置溶溶液澄清清为止，然然后加入入5LL的Goold Vieew核酸酸染料，混混匀即可可用。1.6 方方法.1.6.11 引物的的设计：根据已经克克隆并测测序的内内切葡聚聚糖酶基基因（Gennbannk 登登录号：DQ77829954），结合合信号肽肽预测结结果，应应用Prrimeer ppremmierr5.00软件设设计一对对引物，使使其通过过PCRR去掉该该基因自自身信号号

17、肽编码码序列，同时加加入适当当的酶切切位点（Bgl = 2 * ROMAN II、Sph = 1 * ROMAN I），使其能够通过连接将该基因置于表达载体信号肽编码序列之后（表达载体pHIS1525的多克隆位点序列如图1），且保证正确的阅读框。已经预测的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶蛋白序列信号肽切割位点在29位和30位氨基酸残基之间，成熟蛋白为470氨基酸多肽，因此设计引物如下：上游引物（PP1）：5AAGATTCTCCAGCAAGAGGACAAAAAAACGGCCAAGT 3下游引物（PP2）：5GGCATTGCCCTAAATTTTGGTTTCTTGTTTCCCCCAAA 3下划线是引

18、引入的酶酶切位点点，分别别是Bggl、Sphh；A是是为了不不改变阅阅读框而而引入的的碱基。图1 pHHIS115255的多克克隆位点点序列Fig1 Seequeencee off thhe mmulttiplle cclonningg siitess(MCCS)oof ppHISS152251.6.22 目的基基因的获获得： B3质质粒的提提取及其其PCRR接种一环BB3菌株株于100mL LB液液体培养养基中，3372200rr/miin培养养过夜，用用质粒提提取试剂剂盒按操操作说明明提取BB3质粒粒9。以提提取的BB3质粒粒为模板板根据设设计合成成的引物物进行PPCR10，通过过PCRR

19、获得目目的基因因，其反反应体系系如表22：表2 PCCR反应应体系Tablee 2 Coompoosittionn off PCCR试剂名称 用量ddH2OO 32.5L10PCCR bbufffer 5.0LL25mmool/LL MggCl22 2.0LLP1 1.0LL P2 1.0LLdNTP mixxturre 6.0LL模板DNAA 2.0LL Taqq 聚合合酶 0.5LLTotall voolumme50.0L按上述顺序序加入各各组分后后混合均均匀，PPCR反反应参数数为：994预预变性22 miin，994变变性1mmin，665退退火1mmin，772延延伸900s，330

20、个循循环后，772再再延伸110miin，44保存存。反应应结束后后取3LPCCR产物物进行00.7%琼脂糖糖凝胶电电泳检测测。 PCRR产物的的纯化由于克隆需需要的DDNA片片段需要要较高的的纯度，PPCR产产物需经经过琼脂脂糖凝胶胶电泳充充分分离离后，利利用普通通琼脂糖糖凝胶DDNA回回收试剂剂盒从凝凝胶中回回收目的的DNAA片段11。1.6.33 目的基基因的克克隆: 大肠杆杆菌JMM1099（或DDH5）感受受态细胞胞的制备备：参照分分子克隆隆试验指指南（第第三版），采采用氯化化钙法制制备大肠肠杆菌感感受态细细胞，具具体方法法如下：挑取一环EE.cooli JM1109（或或DH55）

21、菌菌株在LLB平板板上划线线37培养后后，挑取单菌菌落转到到10mmL LLB液体体培养基基中，3372200rr/miin培养养过夜；将上述培养养液按22%接种种量接种种到500mL LB液液体培养养基中3372200rr/miin振荡荡培养22-3小时时；将培养后的的菌液置置冰浴中中10mmin后后转移到到无菌的的50mmL离心心管中，4440000rr/miin离心心10mmin，去去掉上清清液，将将管倒置置1miin使痕痕量培养养液流尽尽；向管中加入入20mmL无菌菌的预冷冷的0.1mool/LLCaCCl2溶液重重新悬浮浮菌体，4440000rr/miin离心心10 minn，去掉掉

22、上清液液；向管中加入入2mLL无菌的的预冷的的0.11moll/LCCaCll2溶液重重新悬浮浮菌体；刚做的感受受态细胞胞可直接接用于转转化试验验，也可可将剩余余的感受受态细胞胞加入终终浓度为为30%的甘油油分装于于1.55mL离离心管（100L/管）置-70保存。 连接与与转化.1 连连接：（连连接体系系12如表3）表3 目的的基因与与pMDD18-T VVecttor克克隆载体体的连接接体系Tablee 3 Thhe lligaatioon ssysttermm试剂名称 用量胶回收PCCR产物物 5 LLpMD188-T Vecctorr 1 LL Ligaatioon MMix 4 LL

23、Totall voolumme10L将该反应管管置PCCR仪116保保温3 h。.2 转转化：（转转化方法法13如下所所述）取装有1000LL E.colli JJM1009感受受态细胞胞的1.5mLL离心管管一支，置置冰浴中中解冻；将上述连接接好的连连接液全全部加入入到上述述离心管管中，并并用加样样器轻轻轻混合均均匀；将离心管放放置冰浴浴中静置置30mmin；30 miin后将将离心管管放置442恒恒温水浴浴中静置置2miin；迅速将离心心管置冰冰浴中静静置5mmin；向离心管中中加入8890L LLB液体体培养基基置377培养养箱培养养90mmin，使使细菌复复苏并表表达质粒粒编码的的抗生

24、素素抗性标标记基因因；取培养后的的菌液2200L用玻玻棒涂布布在含有有1000g/mL氨氨苄青霉霉素的LLB平板板上，将将平板置置37直至液液体被吸吸收后将将平板倒倒置继续续培养112-16 h后可可出现菌菌落。阳性性克隆菌菌株的筛筛选及鉴鉴定将涂布在抗抗性平板板上长出出的菌落落，挑取大大小适中中的单菌菌落进行行菌落PPCR鉴鉴定，反反应体系系如表22。按表2所所述体系系先加入入各组分分液体后后混匀，再分装在0.2mLPCR管中，每管装25L，最后用牙签挑取适量的单菌落作为模板，PCR反应参数为同所述，有一点不同就是：94预变性需5 min。反应结束后取3LPCR产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳

25、检测，能够扩增出与目的基因大小一致的DNA片段初步认为是阳性克隆菌株。阳性克隆菌菌株的鉴鉴定14：将初初步筛选选得到的的阳性菌菌株分别别接种110mLLLB液液体培养养基3772000r/minn培养过过夜，用用质粒提提取试剂剂盒提取取质粒进进行酶切切鉴定，酶切体系如表4和表5。表4 单酶酶切 表5 双酶切切Tablee 4 Siinglle EEnzyyme-cutt meethood Taablee 5 Dooublle EEnzyyme-cutt meethood试剂名称 用量试剂名称 用量10H buffferr 1.00 L10H buffferr 1.00 L质粒DNAA 4.00

26、 L质粒DNAA 4.00 LBgl/Sphh 0.5 LBgl、Sphh各0.5 L ddHH2O 4.5 L ddHH2O 4.0LLTotall voolumme10.0LTotall voolumme10.0L将上述反应应体系置置37恒温培培养箱酶酶切过夜夜，反应应完后向向各体系系中加11L100looadiing buffferr,将其全全部点样样到0.7%的的琼脂糖糖凝胶中中进行电电泳检测测。将酶酶切鉴定定符合要要求的菌菌株随机机取一个个（命名名为KMMQZ33）送TTaKaaRa宝宝生物公公司测序序。1.6.44 表达载载体的扩扩增由于购买的的表达载载体是以以纯质粒粒的形式式提供

27、，需需要将其其转入大大肠杆菌菌内进行行扩增。故故先进行行表达载载体的常常规转化化，再从从大肠杆杆菌中提提取质粒粒进行后后续试验验操作。将购买的表表达载体体pHIIS15525（110gg）用适适量的水水（约220LL）溶解解后，取取1LL转化大大肠杆菌菌DH55感受受态细胞胞（感受受态细胞胞的制备备与转化化方法与E.ccolii JMM1099相同），在在含有1100g/mmL氨苄苄青霉素素的LBB培养基基上筛选选阳性转转化子，并并通过提提取质粒粒和酶切切进行鉴鉴定，将将阳性转转化子命命名为DDH5- ppHISS15225。1.6.55 重组表表达载体体的构建建 内切葡葡聚糖酶酶基因（已已经

28、去掉掉信号肽肽编码序序列）的的准备挑取一环EE.cooli JM1109（含含目的基基因）在在含氨苄苄青霉素素的LBB平板上上划线培培养过夜夜，然后后挑取单单菌落接接种100mL含含相应抗抗生素的的LB液液体培养养基，337剧剧烈振荡荡培养112-14hh后，按按质粒提提取试剂剂盒说明明进行质质粒的提提取，提提取完后后进行琼琼脂糖凝凝胶电泳泳检测提提取质量量和大致致浓度。先先将质粒粒进行BBgl = 2 * ROMAN III单酶酶切，后后进行Spph = 1 * ROMAN I单酶切，两者酶切切体系与与方法一一致。酶酶切完后后向两管管中加入入5.55L100looadiing bufffer

29、r，最后后将两次次单酶切切的质粒粒DNAA进行琼琼脂糖凝凝胶电泳泳，然后后从凝胶胶中回收收所需要要的目的的条带，其其方法与与PCRR产物的的琼脂糖糖凝胶回回收相同同，并取取5LL电泳检检测其回回收的大大致浓度度。 表达载载体的准准备挑取一环大大肠杆菌菌DH55（含含表达载载体质粒粒）在含含氨苄青青霉素的的LB平平板上划划线培养养过夜，然然后挑取取单菌落落接种110mLL含相应应抗生素素的LBB液体培培养基，337剧剧烈振荡荡培养112-14hh后，按按质粒提提取试剂剂盒操作作进行质质粒的提提取，提提取完后后进行琼琼脂糖凝凝胶电泳泳检测提提取质量量和大致致浓度。将将提取的的质粒进进行Bggl和S

30、phh双酶切切。同样，为为了保证证酶切后后回收的的DNAA浓度，需需做3管管该反应应体系。将将上述反反应体系系置377恒温温培养箱箱酶切过过夜，酶酶切完后后向管中中加入55.5L100looadiing buffferr混合均均匀，取取5LL进行电电泳检测测酶切情情况，将将其余反反应液进进行琼脂脂糖凝胶胶电泳，然然后从凝凝胶中回回收所需需要的目目的条带带，其方方法与PPCR产产物的琼琼脂糖凝凝胶回收收相同，并并取5L电泳泳检测其其回收的的大致浓浓度。 连接及及转化将已经准备备好的内内切葡聚聚糖酶基基因与表表达载体体按表66加入进进行连接接反应：表6 连接接体系Tablee 6 TThe lig

31、gatiion sysstemm表达载体/L目的基因/LT4 DNNA liggasee/L连接buffferr/L超纯水/L总体系/L3523215将上述两个个连接体体系置PPCR仪仪中166连接接过夜，转转化时分分别取110LL连接液液分别转转化大肠肠杆菌DDH5感受态态细胞并并涂布在在含有1100g/mmL氨苄苄青霉素素的LBB平板上上，待菌菌落长出出后，进进行菌落落PCRR、酶切切鉴定15,16。2 结果与与分析2.1 目目的基因因的获得得以提取的BB3质粒粒为模板板根据设设计合成成的引物物进行PPCR，获获得的PPCR产产物为不不含目的的基因信信号肽序序列的片片断，其其大小约约为1.

32、5Kbb，对获获得的PPCR产产物取33L进进行电泳泳，结果果见图22。结果表明PPCR产产物大小小与目的的基因大大小（115000bp）接接近。然后对对产物进进行胶回回收，以以去掉PPCR体体系中的的引物、模模板DNNA、酶酶等杂质质，使其其纯度满满足随后后连接要要求，回回收后取取5LL进行电电泳，结结果见图图2。图2 PCCR扩增增产物结结果及产产物胶回回收Fig2 Thhe rresuultss off PCCR aand gell reeclaaim2.2 目目的基因因的克隆隆将胶回收后后的目的的基因与与克隆载载体pMMD188-T Vecctorr进行连连接后转转化E.colli J

33、JM1009感受受态细胞胞，长出出菌落后后挑取大大小均一一的菌落落进行菌菌落PCCR检测测阳性转转化子，菌菌落PCCR结果果如图3所示示。 图3 E.colli JJM1009转化化子的菌菌落PCCR检测测Fig3 Ideentiificcatiion of reccombbinaant E.ccolii JMM1099 byy coolonny PPCR从电泳结果果可以看看出，在在挑取的的9个转转化子中中，有88个转化化子通过过其菌落落PCRR后得到到与目的的基因的的大小相相一致的的产物，只只有9号号转化子子未得到到PCRR产物，说说明它是是一个假假阳性。根根据以上上菌落PPCR结结果，在在

34、288号转化化子中随随机挑取取一个单单菌落（命命为KMMQZ33）接种种10mmL LLB液体体培养基基（含1100g/mmL氨苄苄青霉素素）377剧烈烈振荡培培养122-16hh后按质质粒提取取试剂盒盒操作提提取质粒粒，分别别取3L和55L进进行单双双酶切鉴鉴定，结结果如图4。 图4 E.colli JJM1009转化化子的酶酶切检测测Fig4 Iddenttifiicattionn off E.colli JJM1009 rrecoombiinannt bby rresttricctioon aanallysiis电泳结果表表明：通通过双酶酶切后可可以得到到与目的的基因大大小一致致的条带带

35、，但转转化子质质粒Spph单单酶切后后发现了了两条条条带，和和该质粒粒的双酶酶切结果果一致，经经过分析析发现其其原因是是：PCCR产物物与克隆隆载体ppMD118-TT Veectoor在连连接时没没有按目目的基因因的正向向顺序进进行连接接，刚好好相反，目目的基因因反向连连接在了了克隆载载体上，但但这不影影响本试试验的后后续试验验，酶切切结果表表明目的的基因已已经连接接到了克克隆载体体pMDD18-T VVecttor上上。2.3 表表达载体体的扩增增购买的表达达载体是是以冻干干的质粒粒形式提提供，按按操作手手册说明明需要将将其转入入大肠杆杆菌内进进行常规规的扩增增后再提提取质粒粒进行重重组操

36、作作，故先先进行表表达载体体的常规规转化。将购买的表表达载体体质粒ppHISS15225（约约10g）用用适量的的水（约约20L）溶溶解后，取取1LL转化大大肠杆菌菌DH55感受受态细胞胞（感受受态细胞胞的制备备与转化化与E.colli JJM1009相同同），涂涂布在含含有1000gg/mLL氨苄青青霉素的的LB培培养基上上，待长长出转化化子后（约约24hh），挑挑取大小小均一的的单菌落落接种110mLL LBB液体培培养基，37剧烈振荡培养12-16h后按质粒提取试剂盒操作提取质粒，再分别取3L和5L进行未酶切和单酶切的鉴定，电泳结果见图5。图5 表达达质粒ppHISS15225的酶酶切检

37、测测Fig5 Reestrricttionn annalyysiss off thhe pplassmidd pHHIS115255电泳结果表表明，未未经酶切切的pHHIS115255质粒其其分子量量比实际际分子量量（约77.4KKb）大大，但单单酶切后后分子量量符合实实际大小小，其可可能原因因是质粒粒在复制制过程中中形成了了质粒多多聚体，单单酶切后后未发现现非特异异性切割割，说明明该质粒粒是pHHIS115255质粒。同同时将该该转化子子命为DDH5-pHHIS115255。2.4 重重组表达达载体的的构建2.4.11 内切切葡聚糖糖酶基因因（已经经去掉信信号肽编编码序列列）的准准备通过转化

38、子子的菌落落PCRR和酶切切检测后后，发现现目的基基因（已已经去掉掉信号肽肽编码序序列）反反向连接接在pMMD188-T Vecctorr克隆载载体上，为为保证随随后的酶酶切和表表达载体体的正确确连接，提提取转化化子质粒粒后先进进行Bggl单单酶切，回回收后再再进行SSph单酶切切，这样样通过两两次单酶酶切后保保证了目目的基因因两端分分别是由由Bgll、Spph酶酶切后产产生的粘粘性末端端，通过过两次单单酶切后后用胶回回收试剂剂盒回收收目的条条带，取取5LL电泳检检测其大大致浓度度，结果果见图66。图6 胶回回收的目目的基因因与表达达质粒ppHISS15225 Fiig6 Reeclaaime

39、ed ttargget genne aand plaasmiid ppHISS15225 2.4.22 表达达载体的的准备含表达载体体质粒ppHISS15225的大大肠杆菌菌DH55在含含氨苄青青霉素的的LB平平板上划划线培养养过夜，然然后挑取取单菌落落接种110mLL 含相相应抗生生素的LLB液体体培养基基，377剧烈烈振荡培培养122-14hh后，按按质粒提提取试剂剂盒操作作进行质质粒pHHIS115255的提取取，并对对质粒进进行Bggl、Spph双双酶切，电电泳后切切取目的的条带进进行胶回回收，并并取5L电泳泳检测其其大致浓浓度，结结果见图图6。2.4.33 转化化子的筛筛选及检检测用

40、T4 DDNA连连接酶连连接胶回回收的目目的基因因（即去去掉信号号肽编码码序列的的内且葡葡聚糖酶酶基因）与与表达质质粒pHHIS115255，将连连接体系系置PCCR仪中中16连接过过夜，取取10L连接接液转化化大肠杆杆菌DHH5感感受态细细胞并涂涂布在含含有1000gg/mLL氨苄青青霉素的的LB平平板上，待待菌落长长出后，挑挑取菌落落大小均均一的单单菌落进进行菌落落PCRR，结果果见图77。 菌菌落PCCR结果果表明，转转化子33、5、66、7均均能得到到与目的的基因大大小相一一致的条条带。根根据电泳泳结果随随机挑取取其中的的一个单单菌落培培养后提提质粒进进行酶切切检测，结结果见图图8。

41、图7 E.colli DDH5转化子子菌落PPCR 图88 转化化子质粒粒酶切结结果Fig7 Reecommbinnantt E.colli DDH5collonyy PCCR FFig88 Resstriictiion anaalyssis of reccombbinaant结果表明，质质粒经过过单酶切切后没有有出现非非特异性性条带，双双酶切后后可得到到与目的的基因大大小相一一致的条条带，说说明目的的基因包包含的该该质粒中中。通过过对转化化子进行行菌落PPCR及及其质粒粒酶切检检测，表表明重组组质粒已已经转进进了大肠肠杆菌DDH5中。将将该菌命命为pHHEC-Endd。3 讨论3.1 芽芽孢

42、杆菌菌作为表表达体系系的优点点芽孢杆菌为为革兰氏氏阳性细细菌，细细胞壁不不含内毒毒素，能能分泌大大量的蛋蛋白到体体外，能能形成芽芽孢，是是一些重重要工业业酶制剂剂的生产产菌。自自19558年SSpizzizeen117发现枯枯草杆菌菌1688菌株能能摄取外外源基因因以后，随随着DNNA重组组技术的的发明，特特别是金金黄色葡葡萄球菌菌(Sttaphhyloococccuss auureuus)带带抗性标标志的质质粒可作作为其载载体的发发现，芽芽孢杆菌菌基因工工程的工工作迅速速发展。作作为很有有吸引力力的外源源基因表表达的宿宿主，芽芽孢杆菌菌有以下下一些优优点:除炭疽杆菌菌(Baacillluss

43、 annthrraciis)和和蜡样芽芽孢杆菌菌(Baacillluss ceereuus)等等外，多多数芽孢孢杆菌对对人畜无无害，不不像大肠肠杆菌那那样具有有热源性性脂多糖糖。遗传学现在在相当先先进，很很多噬菌菌体和质质粒适合合于用作作克隆载载体。具有蛋白分分泌能力力强的特特性。当当分泌蛋蛋白跨过过细胞膜膜后，就就被加工工和直接接释放到到培养基基中，这这使得回回收和纯纯化目的的蛋白较较为简单单。良好的发酵酵基础和和生产技技术。芽芽孢杆菌菌在工业业上长期期被用于于生产蛋蛋白酶、aa-淀粉粉酶以及及苏云金金杆菌的的杀虫晶晶体蛋白白等。在在相对简简单的培培养基中中能生长长到很高高的密度度。细胞胞的

44、生长长特性和和生理学学性质都都被广泛泛、深入入研究。经过几十年年的努力力，芽孢孢杆菌表表达系统统的优越越性得到到发挥，许许多原核核和真核核基因被被克隆和和表达，其其中有的的己应用用于工业业生产，取取得了不不少成绩绩。但是是，用芽芽孢杆菌菌作为产产品生产产菌也暴暴露出一一些问题题:蛋白白酶对目目的蛋白白的降解解，质粒粒的不稳稳定，真真核蛋白白分泌表表达量低低或不能能分泌表表达等。3.2 信信号肽对对外源基基因表达达的影响响信号肽对外外源基因因分泌表表达至关关重要，同同一种蛋蛋白酶在在不同信信号肽的的作用下下，即使使都能分分泌表达达，其分分泌效率率也会相相差甚远远。Yaang Yanng118等等

45、人研究究表明：当使用用巨大芽芽孢杆菌菌的胞外外脂酶的的信号肽肽代替自自身的信信号肽时时，可提提高青霉霉素酰胺胺酶G表表达量11.7倍倍；Naagarrajaan19选择了了枯草杆杆菌蛋白白酶、中中性蛋白白酶、芽芽孢杆菌菌RNAA酶和果果聚糖蔗蔗糖酶等等四种酶酶的信号号肽，以以芽孢杆杆菌BEE15110为宿宿主菌，分分别研究究它们对对重组链链霉抗生生素蛋白白分泌效效果的影影响。结结果表明明，携带带四种融融合基因因的菌株株都能有有效分泌泌四聚体体链霉抗抗生素蛋蛋白，但但以用中中性蛋白白酶信号号肽时效效率最高高。大肠肠杆菌由由于细胞胞壁结构构与芽孢孢杆菌不不同，很很少能将将外源蛋蛋白分泌泌在胞外外，

46、大多多在胞内内形成包包含体的的形式。在在大肠杆杆菌中似似乎信号号肽的存存在对外外源基因因的表达达存在不不利，如如李相前前等20通过PPCR方方法分别别克隆CCel 12BB完整基基因和不不带信号号肽基因因至pEET一220b载载体，构构建重组组质粒ppET-20bbCeel122B和ppET一一20bbCell12BB-WSS，转化化至大肠肠杆菌JJM1009DEE3诱导导表达后后，分析析酶活，结结果表明明去除信信号肽重重组菌单单位酶活活是未去去除信号号肽重组组菌的111倍多多。3.3 引引物的设设计Ryguss T21、Yaang Yanng22均报道道表明，外外源基因因在表达达载体的信号号

47、肽引导导比基因因自身信信号肽引引导下具有较较高的表表达水平平。Yaang发发现来自自Theermoobiffidaa fuuscaa的水解解酶只有有其密码码子适合合巨大芽芽孢杆菌菌时才能能成功的的表达，黄黄玉杰等等23人在巨巨大芽孢孢杆菌中中克隆到到了编码码内切酶酶的基因因，该基基因片段段同己发发表的枯枯草芽孢孢杆菌gglyBBapprE之之间的同同源性为为35；同芽芽孢杆菌菌BP223 ccelBB、短小小芽孢杆杆菌内切切葡聚糖糖酶和多多粘芽孢孢杆菌- 11，4-内切葡葡聚糖酶酶的编码码基因的的同源性性只有227。表表明巨大大芽孢杆杆菌在密密码偏爱爱性上与与其他芽芽孢杆菌菌存在着着差别。因因

48、此，在在设计引引物时，通通过分析析巨大芽芽孢杆菌菌和编码码该基因因的密码码子使用用频率，引引入碱基基A。使使编码的的内切葡葡聚糖酶酶能够正正确的与与表达载载体pHHIS115255上的信信号肽融融合而不不至改变变阅读框框。在本本实验中中，我们们通过PPCR去去除枯草草芽孢杆杆菌C-36内内切葡聚聚糖酶基基因中编码信信号肽的的序列。4 结论 本本实验成成功去除除枯草芽芽孢杆菌菌C-336内切切葡聚糖糖酶基因因中编码码信号肽肽的序列列，并且且将去除除信号肽肽的枯草草芽孢杆杆菌C-36内内切葡聚聚糖酶基基因与巨巨大芽孢孢杆菌表表达载体体pHIIS15525进进行连接接，成功功构建了重组表表达载体体。

49、参考文献1 谢谢占玲，吴吴润.纤纤维素酶酶的研究究进展.草业科科学JJ,220044,211（4）:72-75.2 徐徐昶，龙龙敏南，邬邬小兵等等.高产产纤维素素酶菌株株的筛选选及产酶酶条件研研究JJ.厦厦门大学学学报（自自然科学学报），220055，444（1）：1077-11113 沈沈学亮，夏夏黎明.产纤维维素酶细细菌的筛筛选及酶酶学特性性研究J.林产化化学与工工业，220022，222（1）：47-514 李李育阳. 基因因表达技技术MM. 北京, 科学学出版社社, 220022：266-2995 VVaryy PSS. PPrimme ttimee foor BBaciilluus

50、mmegaaterriummJ. MMicrrobiioloogy, 19994, 1440: 10001-1101336 RRyguus TT, HHilllen W. Indduciiblee hiigh-levvel exppresssioon oof hheteerollogoous gennes in Baccilllus meggateeriuum uusinng tthe reggulaatorry eelemmentts oof tthe xyllosee-uttiliizattionn opperoonJJ. Apppl.MMicrrobiiol.Biootecchnool.

51、,19991, 35: 5994-55997 鲁鲁小城，赵赵宇华，方方萍.枯枯草芽孢孢杆菌FF-2抗抗植物病病原真菌菌活性物物质的研研究JJ.浙浙江大学学学报（农农业与生生命科学学版），220077，333（1）：34-398 JJ.萨姆姆布鲁克克, KK.W.拉塞尔尔著.黄黄培堂译译. 分分子克隆隆试验指指南MM.第第三版, 北京京, 科科学出版版社, 20002：55.400-5.46）9 殷殷蔚中.食品微微生物学学M.北京京：中国国财政经经济出版版社，119911：2331-223710 孙大庆庆，闫冰冰，赵宁宁等.应应用于转转基因食食品检测测的PCCR技术术及其进进展JJ.中国国粮油学

52、学报，220077，222（1）：1088-111311 蒋卫民民.HIIV-11 p224和ggp411融合基基因载体体的构建建以及融融合蛋白白在原核核细胞中中的表达达D.20004复旦旦大学博博士学位位论文. 20004.412 潘延凤凤，潘延延凤，贺贺永文等等 HYPERLINK 9:90/Search/HotLink.aspx?database=qikan&constFieldName=%e4%bd%9c%e8%80%85&constFieldValue=WANG+Hua&expression=%e4%bd%9c%e8%80%85+exact+%22WANG+Hua%22&constD

53、B=qikan&noFilter=false . PAAP-aa/CDD81-LELL融合蛋蛋白表达达载体的的构建J .中中国现代代医学杂杂志，220055，155（199）：229099-2991113 邵碧英英，陈文文炳，杨杨婕.转转基因产产品中外外源基因因克隆、转转化体系系的建立立J.食品品科技，220066,466(4):466-49914 解玉红红，宋文文华，葛葛艳辉等等.土壤壤和空气气中纤维维素酶高高产菌株株的筛选选J.生生物技术术通讯，220077,188（1）:68-7115 罗立新新,黄志志立,凌凌均建等等. 纳纳豆激酶酶基因重重组表达达载体的的构建及及其稳定定性JJ.华南理理工大学学学报（自自然科学学版）.20001,229(44