干扰设计方法

1、siRNA设计指南使用来实现基因沉默是在分子生物学方面进展迅速的方法有几种制备的方法比如化学合成体外转录表达载体和表达盒不管用那种方法设计的第一步是选择的目的位点下面选择目的位点的指南是基于当前文献和在的科学家们的观察经验用这些指南设计出的所有干扰片段中其中大约有半数可以产生目的基因转录水平大于50的%下降.当前已与在研究领域的领头人一合伙已经提出了一个具有专利权的设计运算法则当与按照下面的设计路线设计的相比可以产生更高的有效比例对于运算法则的信息可以参看设计更好部分你可以从订购你提前设计好的，根据运算法则用化学法合成的当前对于在数据库中的人类，小鼠和大鼠基因，超过的是可以设计出来的想得到更多

2、信息，可以参看提前设计的目录页而且，提供对许多重要的人类基因行之有效的沉默子这些被实际测试核实后，发现可以致使目的基因水平大于70的%下降.一总体的设计指导方针如果你喜欢自己设计，你可以根据下面的指导方针，在许多不同的生物体中选择目的位点相应的可以被化学合成，通过体外转录产生，从载体中表达或者用扩增在目的mRNA中找出以AA二核苷酸开头的21个核苷酸序列.从转录起始密码子开始，寻找二核苷酸序列将每个二核苷酸和它的3端的1个核苷酸序列记录下来，作为可能的目的位点.这种选择目的位点的策略是基于的观察报告.（1）3端有的二核苷酸是最有效的这也同用聚合酶转录发夹是相一致的，因为聚合酶是在有个聚合的位置

3、终止转录的，从而产生带有短的聚合尾巴的分子.在的和随后的出版物中，3端带有其它末端二核苷酸的也可以有效的介导如果你愿意的话，你可以更改这种目的位点的选择策略，使设计的带有其它的末端二核苷酸，但有一点，我们推荐你尽量避免末端为残基，因为这样的话，就极有可能被酶在单链上残基的位点将切断.选择2-4个目的序列.在的研究发现，一般超过半数的随机设计的可以致使目的的转录水平至少降低，并且大约有四分之一的能使目的的转录水平下降根据下面的指导方针，从第一步中记录的序列中选择目的位点：的研究者们发现含量在3的比有更高含量的更具有活性.既然对于聚合酶来说，个核苷酸聚合的位点是作为一个转录的终止信号，所以在设计要

4、从聚合酶启动子处表达的时，要避免含有延伸超过个或的目的序列.既然的某些区域可能被调控蛋白质高度组装或结合,我们一般沿着基因序列，在不同的位置来选择目的位点我们迄今为止，还没有发现在上的目的位点的位置与能力有任何相关性.比较可能的目的位点与合适的基因组数据库（人类，小鼠，大鼠,等等）以及排除带有超过16-个17邻近碱基的目的序列与其他编码序列的同源性的考虑，我们建议用软件，这个可以在服务器上找到设计合适的控制.一个完整的实验应该包含有许多控制来确保数据的正确性自然细胞生物学的编辑推荐了几个控制.其中的两个表述如下：一种是负控制的，它跟你设计的有着相同的核苷酸组成，但是与基因组序列缺少大的序列同源

5、性.要设计一种负控制的R先打乱特异性基因的的核苷酸序列，然后在基因组序列中进行搜索来确保它缺少同任何其它基因的同源性.额外的针对相同的的序列也许进行实验是确定数据有效的最好的方式，在某次用一种时，连同针对同一个基因的两个或者更多的不同的一同使用在进行这些实验之前，应该测试每一个，确保它能在相当高的水平上可以降低目的基因的表达二Ambion的siRNA目标位置寻找程序使用我们的在线目标位置寻找软件来找出可能的序列，是基于上面的设计指南只用简单地把你的序列粘贴到窗口中，这个程序就会扫描你的序列来找出二核苷酸并且产生出一个报告，显示二核苷酸的位置，个目的碱基,相应的有义和反义寡核苷酸链然后目的可以被

6、直接提交到我们的特异设计工具中，或者通过点击目的下感兴趣的相应链接，来进行搜索.另一个可供选择的是，位于（麻省理工学院）的生物医学研究学院有一个公开可用的设计工具，可以进行额外参数选定，并且整合有人类和小鼠基因组数据库的搜索参看：（需要注册）三对于设计siRNA表达载体和siRNA表达盒编码的siRNA发夹结构的详细指南最初报道的用表达载体来诱导的研究者们在对于编码表达的插入序列有各不相同的设计标准绝大多数的设计中都含有被用一小段间隔序列分开的两段反向重复序列，并且以一系列的作为转录终止位置的来结束这些设计产生的转录，被认为会折叠成如图一所示的一段短的呈发夹结构的但诸如，目的序列的选择，编码推

7、定的发夹结构茎的反向重复序列的长度，反向重复序列的前后次序，编码发夹结构环的间隔序列的长度和组成，5突-出末端的存在和缺失，在不同的报道中都是有所差异的(3-11)图一表达载体或者表达盒产生的典型发夹的示意图及它同目的序列的关系四Ambion推荐的设计siRNA发夹结构的程序下面的介绍的发夹结构的设计和克隆策略是基于的科学家们的研究结果.设计合适的插入序列的第一步是按照上面表述的总体的设计指导方针的步骤来选择目的位点为了筛选，我们一般对每个目的基因测试四个序列，并且让这几个序列沿着基因序列间隔排布，目的是为了减少目地区域正好与调控蛋白质组合或结合的机会因为对每个目的基因都组装并且检测四个表达质

8、粒是很费时间的，我们发现用源于表达盒的产物法来筛选可能的序列是容易多了是指包含有启动子和终止子序列，并连接有发夹结构模板的产物，可以被制备成的沉默子的表达工具这种筛选策略也可以对在实验系统中的启动子和序列的最好结合进行快速的鉴定被发现可以有效使得基因沉默的可以被很容易地被克隆进一个载体,从而进行长期的研究的科学家们已经确定那些作为转染有很好功能的序列在作为中表达的时一样有很好的功能唯一的差别是在中表达的序列不应该含有一系列的四个或五个或，因为这些能作为聚合酶识别的终止位点对于传统的克隆进载体的方法，编码选定的序列的两条寡聚核苷酸链被设计插入到载体中(图和图)一般而言，寡聚核苷酸链是由个有义s序

9、列靠一段短的间隔子与它的颠倒的互补的反义序列相连构成的科学傢们已经成功使用了个核苷的间隔子，尽管其它的间隔子也能被设计5个被加到寡聚核苷酸的3端而且，为了克隆到ener载体中，o和限制性酶切位点被分别加入到寡聚核苷酸链的5和3末端（图）与此相对的是，为了克隆进ener3载体中，ao和3n限制性酶切位点被分别加入到寡聚核苷酸链的5和3末端（图3）预期的转录产物将会向后折叠，形成茎环结构，茎由组成，环由个核苷酸组成，并且在3末端有2载3（体图1）.图对于载体ener的插入部分的设计这个插入部分对于ener载体是特异性的，并且包含有适当的3overhangs，为了能按一定方向克隆进这个载体.环的序列

10、和长度能按照希望的进行改变.图3对于载体ener和eher插入部分的设计，设计的插入序列对于ener和3表达载体是特异性的，并且包含有适当的5突出末端，是为了按方向克隆进这些质粒中对于在图中显示的ener载体，早期有迹象表明，在环结构设计中，有大量的区域都可用；这里我们提供了我们发现很好的一个环的序列为了克隆进eneraeno载体，为此设计的带有茎环结构的寡聚核苷酸链与上面表述的克隆进ene和3载体的结构很相似尽管如此，对于基于的载体的寡聚核苷酸链的一个显著的差别是它的3末端5个的缺失，因为对于基于的载体系统的转录终止信号是由聚合终止子提供的而且，为了克隆进enceeno载体，ho和e限制性内

11、切酶酶切位点被分别加入到寡聚核苷酸链的5和3末端（图）尽管如此，为了克隆进ener载体，包含有a和n限制性酶酶切位点的核苷被分别加到寡聚核苷酸链的5和3末端（图5）图对于eneraeno载体插入部分的设计插入部分的设计对于载体是特异性的，并且包含有合适的突出末端，为了可以按方向克隆进这个载体.环的序列和长度可以按需要进行改变.图对于载体插入部分的设计插入部分的设计对于载体是特异性的，并且包含有合适的突出末端，为了可以按方向克隆进这个载体.环的序列和长度可以按需要进行改变.通过沉默子表达工具用方法制备包含有或者启动子的，（）一个或两个编码序列的寡聚核苷酸链被设计和订购，（）寡聚核苷酸链在一个或多

12、个中用做引物，中包含有含有启动子的来自于现成工具的模板，（）产物经过柱层析纯化尽管其它的环序列也可以被设计，但的科学家们一般用环结构来进行他们的对于载体插入部分的设计中，作为聚合酶终止子的一段个终止序列被加入为了随后克隆的便利，和限制性酶切位点也加入引物序列中用沉默子表达工具来设计寡聚核苷酸链引物的详细设计参数可以被在工具的操作工序说明书中找到.为了将源于的功能性沉默子表达工具克隆进载体，和目的载体都需要用和进行酶切制备被称作载体，即带有新霉素，潮霉素，嘌呤霉素抗性基因的线性化的目的载体，是可行的.五siRNA目标的选择除了改进的运算法则和我们建议的程序，通过扫描序列中的二核苷酸并记录下紧挨着

13、的个核苷酸，依此来作为的目标位置外，其它两种方法已经被其它的研究者所采用在第一个方法中，目标序列的选择纯粹是由经验决定的（），只要目标序列以开头，并且通过分析同其它基因没有很大的序列同源性.在第二个报道中，又一个精心设计的方法被采用来选择目标序列这个程序采用了观察方法，即在内在的中，能被合成的寡脱氧核糖核苷酸酶降解的目标位置，就是可以被利用的位置（）在这种方式中鉴定出的任何可利用的位点被用作在含有启动子的中结构的插入序列相关信息.参看在设计运算法则中的设计一个更好的的相关信息六在发夹结构siRNAs中的有义链和反义链的次序一个发夹结构表达盒经常被构建成包含有目标基因的有义链，紧跟着一小段间隔子

14、，然后是目标基因的反义链的这样一种次序.一组研究者已经发现颠倒在表达结构中的有义链与无义链次序并没有影响发夹结构（）的基因沉默活性与此相反的是，另一组研究者发现在另一个表达盒中相似的次序颠倒则造成了发夹结构（）在导致基因沉默活性方面的部分下降.对于究竟是什么原因致使出现这种差别还并不清楚.在当前，仍然被认为合理的表达盒的构建次序依次为，有义链，短的间隔子，反义链七siRNA茎的长度在用做表达盒茎结构的核苷酸序列的长度选择上，有着不同程度的差异一些包括的研究组织用个核苷长度的序列作为表达盒的茎结构（）与此相对的是，其它的研究组织所用的茎长度，从个核苷长度（4-）5到25-个2核9苷长度（1）1不

15、等.但发现这些有不同茎长度的发夹在基因沉默研究中都有很好的功能八在发夹结构siRNA中连接有义链与反义链的环的长度和序列不同的研究组织已经成功报道了用带有从个核苷环的发夹实现基因沉默的结果（4，6-，结构所做的总结：91）1.下面是对被不同研究组织使用的环长度和序列环长度（核苷）特异环序列使用的科研组织数3AUG43CCC74UUCG55CCACC7CTCGAGAAGCUUTOC o 1-5 h z7CCACACC79UUCAAGAGA623没有报道9九在发夹siRNAs中5突出末端的出现绝大多数研究组织在他们的发夹结构中没有加入5突出末端（-）尽管如此，一个研究组织在发夹结构（）中加入了包含

16、有个核苷的5突出末端这些含有5突出末端的发夹在基因沉默中也是有功能的.十siRNA的化学合成合成顾客设计的和用运算法则提前设计的为了订购用化学合成的，你已经设计好的，你可以提供：序列上的个碱基（以二核苷酸开始），依次来指导的合成.或者每个链的序列（如果你想让你的具有除了或着的3末端，我们推荐你用这个.）将根据你提供的序列，来合成寡聚核苷酸链互补序列默认情况下，你只提供目标序列的话，相应的带有3突出末端的将被合成如果你愿意的话，你可以选择或者其它的突出末端我们的科学家们发现带有或者突出末端的在功能方面并没有差异（注意：有义链3不必非得跟目标基因互补）当前，设计的，对于保存在上数据库中的大于的全人类，小鼠和大鼠基因组序列，都是可用的.为了订购一个提前设计的,首先在我们的数据库中搜索你感兴趣的基因，然后选择你想要支付的设计