荧光定量PCR仪参数比照表

1、荧光定量PCR仪参数比照表口岫 品牌QIAGENRocheBio-RadABI比较参数Rotor-Gene Q 5- plex+HRM480CFX96 / IQ5ABI 7300 ( 32000)激发光源LED （发光二极管） 每个通道配备独立的LED光源，HRM为独立的通道氙灯LED / 1个卤素灯卤钨灯：光强逐渐衰 减，寿命短，每2-3个 月需要更换一次。独立光源和 滤光片独立光源和滤光片， 每个通道均得到特 异，均一的激发；最 小的光谱重叠， 6个LED独立激发， 无需预热，使用方 便，即开即用，自动 开关光源，即使过 夜，也不用担心光源 会烧坏棱镜折射，光谱重叠及 相互的干扰，需要预

2、热，实验结束必须关 机；氙灯使用寿命仅1000- 2000小时，一两年必 需更换，氙灯更换成本 更高达几千美金；且它 们的光强会不断衰减， 影响结果稳定性96个光纤检测，移动 检测，稳定性差，需 要预热，实验结束必 须关机；光路需要复杂调校， 仪器搬动后也需要专 业调校棱镜折射，光谱重叠及 相互的干扰，需要预 热，实验结束必须关 机；卤钨灯使用寿命仅 1000-2000 小时，一两 年必需更换，氙灯更换 成本更高达几千美金； 且它们的光强会不断衰 减，影响结果稳定性激发光范围365-670nm450nm,483nm,523nm,588nm,615nm400-700nm / 450- 730nm

3、500-660nm荧光检测器PMT （光电倍增 管）：灵敏度高CCDCCD /二级管低温CCD：灵敏度 低，检测线性范围较窄升降温速率升温15C/秒；降温 20。/秒。升温 4.8C/sec 降温 2.5C/sec升温5C/sec 降温 3.3C/sec基座的平均升降温速度 3.5C/秒，样品实际平 均温度变化速度为1C/ 秒温度均一性0.01 C0.2 C0.5 C0.5 C温度分辨率0.02 C 0.1 C 0.2 C 0.25 C线性范围与 区分度10个数量级（1-101Q 能清晰区分单个拷贝10个数量级9个数量级9个数量级温度范围室温-99 C4-99 C4-99 C4-99 C反应体

4、系最低可以做5微升体 系，节省试剂5-100ul 体系10-50ul 体系只能做到10微升体系内参温度均一性好，没有 光程差，不需要加ROX内参96孔板有光程差，必 须加ROX内参96孔板有光程差，必 须加ROX内参温度均一性不够好，96 孔板有光程差，必须加 ROX内参，增加了成 本HRM分析技术上专用的HRM分析工 具，可自动分类/型， 突变检测等需要增加软件的功能， 不同的软件，HRM功能表现不 好，无文献支持HRM功能表现不好，无 文献支持耗材耗材开发专用耗材，顶部无法标 记专用耗材，顶部无法 标记专用耗材，顶部无法标 记SNP类型碱基变化1C/T 和 G/A2C/A 和 G/T3C/

5、G4A/T很小02C典型的Tm变化较大0.5C稀有性 (人类) 64% 20% 9% 7%这个表格反映的是碱基的不同，带来的Tm值的变化，可以看出A/T之间的突变， 需要温度分辨率小于 0.2C才能区分开，而象AB等其它公司的分辨率是土 0.25C，所 有它是区别不开第四类的SNP变化的，HRM技术的发明者，曾发表过一篇文章，用市场上所有能做HRM机器的定量，做 了一次比较，结果显示QIAGEN Rotor-Gene Q是能做的最好的一个公司； 文章全文可见以下链接：Herrmann et al 2007 Clinical Chemistry 53,http:/www.clinchem,org

6、/cgi/content/abstract/clinchem,2007088120v1 Expanded Instrument Comparison of Amplicon DNA Melting Analysis for Mutation Scanning and GenotypingFig 1 (detail) Normalized melting curves of a 110 bp B -globin amplicon (triplicate HRM data)以下是一些关于定量PCR HRM （High Resolution Melt中文：高分辨 率熔解曲线）一些介绍！（QIAGEN

7、）有2个最显著特点：1）是温控精度非常高（温度均一性：0.01C，温度分辨率：0.02C ）及 升降温速度非常快（升温可达15 c/秒，降温可达20C/#）2）是区别与其它的公司定量PCR的是它的HRM功能，这个是其 它厂家都无法能做到的（比如ABI 7500Fast及其它公司这种板式加热系统， 因为它的温度分辨率达不到）QIAGEN是一个集遗传分析和定量完美结合 的一款机器；现阶段，大家检测SNP时都用一贯的检测方法，包括测序，探针还有 DHPLC等等而甲基化大多用MSP.至于HRM技术并不为大家所熟知，有 两个原因：1）适合做HRM技术的仪器在国内的普及程度不高，具我了解能真正能够做HRM

8、 的只有 QIAGEN Roter-Gene Q+HRM 系列和 Idaho LightScanncer.Roche；其中QIAGEN在其温度控制及软件分析上是做的 最好的.（其它的比如ABI 7500 Fast及伯乐也对外宣传它的HRM功能，但由 于它的温控精度，决定了它做HRM功能是做不好的，可见也是一个赶时髦的功 能，也只能通过软件的模拟来处理）2）HRM的实验灵敏度太高，影响实验因素过多，很多人都做了，但是就是做 不出来.因此就放弃，就换用其他比较成熟的方法.殊不知,HRM技术的检测 方法有其他技术难以比拟的优势，不仅能实现高通量和高精度的同 时,PCR和荧光定量在同一管内进行，能够有

9、效避免假阳性. （QIAGEN在上海 有个用的非常好的用户，是交通大学华山医院的 关明主任，用这个机器发表 了一篇非常好的文章，如果老师有兴趣，可过去看看）作为新一代的遗传扫描工具,HRM具有简，效，快,廉等其他技术难以比拟 的优势：简：无需序列特异性探针，不受碱基位点局限，同时检出已知或未知突变、 SNP和甲基化位点：闭管操作，避免交叉污染。效：最低检测0.1%-0，01%的突变或异常甲基化，检测SNP灵敏度和特 异性均为100%。快：1次同时检测几十个样本，在一个小时左右就完了成检测。廉：简化操作步骤、降低人工和试剂成本，费用远少于测序、Taqman探 针等方法。价格就几毛钱（2毛人民币）；其它用定量PCR来做SNP研究的方法，都只能对已知SNP进行分 析，而且基本都需要合成序列特异性探针，局限性和费用都比较大，一来 只能做已知的SNP，二来需要合成序列特异性探针。而HRM则不受这 些条件的限制，既可做已知位点又可做未知位点，且无需序列特异性探 针，费用大大降低，应用的灵活性也大大提高。H