HIF1、COX2在实验性高原重症急性胰腺炎中的表达

1、HIF-1、COX-2在实验性高原重症急性胰腺炎中的表达【摘要】目的讨论hif-1和x-2在高原重症急性胰腺炎(sap)中的作用以及二者之间的关系，初步讨论高原sap的发病机制，为更好的诊治sap提供理论基矗方法将72只spf级安康雄性istar大鼠随机根据海拔不同分为3个大组(每组24只)，再将每个大组随机分成4个小组(每组6只)。采用向胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠的方法建立sap动物模型。sap组(p组)在造模后的第6、12、24h分批处死大鼠，假手术组(n组)在造模后6h处死大鼠，分别测定血清淀粉酶(ay)、胰腺组织缺氧诱导因子(hif-1)和环加氧酶-2(x-2)含量，观察胰腺组织病理

2、变化并评分。结果p组各时点的胰腺病理评分及ay、x-2、hif-1均较n组显著增高(p0.05)。三个海拔的p组相比，胰腺病理评分及hif-1、x-2的表达具有显著性差异(p0.05)。hif-1、x-2、he评分呈正相关(p0.05)。结论hif-1、x-2在sap的早期即被激活，被激活因子可能在sap的始发阶段起重要作用;hif-1与x-2亲密关联;hif-1、x-2在高原sap的发生开展中起重要作用。【关键词】重症急性胰腺炎高原缺氧诱导因子-1环氧合酶-2severeautepanreatitisatplateauanyaning1,uxinin1,guyain1,zhangxiafen

3、g2(1.qinghaiprvinepepleshspital;2.linfenityfshanxiprvinepepleshspital)abstratbjetivetinvestigatetheeffetfhypxia-induiblefatr-1(hif-1)andylxygenase-2(x-2)insevereautepanreatitis(sap)atplateauareaanddisusstherelatinshipbeteenhif-1andx-2inrderthatlarifyingtheehanisfsapandprvidingthebasisfrtreatentfthis

4、disease.ethds72speifipathgenfree(spf)istaraleratseredividedintthreegrupsrandly(n=24ineahgrup).everygrupassubdividedintfursubgrups(n=6ineahgrup).panreatitisdelasinduedbyintra-dutadinistratinf5%nat.theexperientalgrupastreatedat6h,12hand24hafternatinjetinandtheshagrupat6thafterperatin.thententsfaylasei

5、nseru,histlgialsresfpanreatitissuesandthententsfhif-1andx-2inpanreatiereeasuredrespetively.resultsparedtshagrup,seruaylaselevel，hif-1andx-2inpanreatitissuesandhistlgialsresfpanreatitissueseresignifiantlyinreased(p0.05)insapgrup.thereasasignifiantdifferene(p0.05)inhistlgialsres,ntentfhif-1andx-2angth

6、reealtitudessapgrup.thereasshnapsitiverelatinship(p0.05)anghistlgialsres,hif-1andx-2.nlusintheexpressinfhif-1andx-2ayplayaniprtantrleinearlystagefsapandthetfatrsshapsitiverelatinship.hif-1andx-2aylselyrelateithpathgenesisandprgnsisfplateausap,t.keyrdssevereautepanreatitisplateauhypxia-induiblefatr-1

7、ylxygenase-2重症急性胰腺炎(severeautepanreatitis，sap)起病急、进展快、病情危重、并发症多、死亡率高。众多学者致力于其发病机制的研究，并不断获得新的进展，但至于详细发病机制仍不明晰。在高原地区的sap由于低氧血症和血液粘稠度增高，致使病情更加严重，治疗更棘手1。因此高原胰腺炎有其自身的特点。对于高原sap发病机制的研究在国外很少，国内尚属空白。近来的研究认为sap早期即有缺血缺氧情况，并因此发生一系列的病理生理变化，致sap加重，然而这一详细过程如何发生尚未清楚。缺氧诱导因子-1(hypxia-induiblefatr-1,hif-1)作为在缺氧的适应性反响

8、中的核心因子2，最初的研究重点在机体耐受缺氧、维持肿瘤细胞的能量代谢、新血管生成3等方面。随着研究的深化，发现hif-1调节的靶基因数目逐渐增多，对hif-1所发挥的作用认识也逐渐全面。graer等4人证实了hif-1在炎症中的重要作用。因此，hif-1可能在sap，尤其在高原sap中发挥重要作用。环加氧酶-2(ylxygenase-2,x-2)与炎症关系亲密，ethridge等5利用x-2基因敲除的小鼠来制造sap的动物模型，结果发现胰腺几乎没有炎症改变。本实验通过在不同海拔建立sap动物模型，观察在不同海拔动物sap中的hif-1、x-2表达程度、血液生化指标和胰腺组织病理变化，旨在讨论h

9、if-1、x-2在高原sap中的作用机制。1材料与方法1.1实验材料及试剂安康雄性spf级istar大鼠72只，体重(20020)g，购于甘肃中医学院实验动物中心(动物合格证号：sxk2022-0006)。牛磺胆酸钠(nat)购于意大利inalspa公司，兔抗大鼠hif-1多克隆抗体、x-2酶标偶合液、sab试剂盒、dab显色剂均购于北京博奥森生物公司。1.2动物分组72只大鼠随机分成3个大组：海拔1500组(l组)、海拔3300组(组)、海拔4300组(h组)。每个大组随机分成4个小组：假手术组(n组)、胰腺炎6h组(p6h)、胰腺炎12h组(p12h)、胰腺炎24h组(p24h)。l组从兰

10、州(海拔1500)购置回后立即进展造模，其余大鼠送入河卡(海拔3300)、温泉(海拔4300)地区习服20天后在当地造模。1.3动物模型的制作各组实验大鼠术前禁食12h，自由饮水。用1%苯巴比妥钠(4l/kg)行腹腔注射麻醉。n组大鼠翻开腹腔后，仅对胰腺翻动数次后关腹。p组探查到肝总管后，用无创血管夹夹闭。术者右手用4.5号钝头注射器从十二指肠肠系膜对侧选一无血管区进针，刺穿外侧肠壁，自乳头插入胰胆管，左手轻轻捏住进针处胰胆管，防止针头滑脱。缓慢注入5%nat(1l/kg)。30s后可见胰腺充血，拔出针头，松开血管夹，压迫肠管穿刺点5in后关闭腹腔。n组于造模后6h全部处死，p组在造模后第6、

11、12、24h三个时点分批处死。分别自腹主动脉采血;切取胰腺组织。1.4测定工程及方法用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清淀粉酶(aylase,ay)含量，大鼠胰腺组织常规以苏木素-伊红(heatxylin-esin,he)染色并行光镜观察，然后根据greal6评分标准进展评分(见表1)。应用免疫组化sp法分析各组大鼠胰腺hif-1染色程度，以细胞浆或细胞核有棕黄色颗粒为阳性细胞，否那么为阴性，根据牛彦锋7等评分标准进展评分。取局部胰腺组织匀浆后，用elesa法测定各组大鼠胰腺组织x-2含量。首先测定出标准浓度值，绘出标准曲线，根据标准曲线计算样本的浓度。x-2含量标准曲线见图1。图1x-2的标准

12、曲线表1sap胰腺病变严重程度评分标准(改进greal法)组织病变评分标准01234水肿无轻度叶间隙增宽重度叶间隙增宽腺泡间隙增宽细胞间隙增宽坏死面积比无1%10%11%20%21%30%30%炎症每5个炎症细胞计0.5分，超过30个计4分出血无有出血-注：得分=水肿评分+坏死评分+炎症评分+出血评分.1.5统计学处理方法所有数据均用spss11.5统计软件完成，实验数据均以均数标准差(xs)表示。组内及组间比拟用ne-ayanva，并用snk进展两两比拟;病理评分及x-2、hif-1的相关关系采用pearsn相关分析。检验水准取=0.05。2结果2.1胰腺组织病理改变及评分结果n组大鼠根本正

13、常;p6h组胰腺水肿、血管周围有炎性细胞浸润;p12h组腺泡细胞变性、大片出血、腺泡间有炎性细胞浸润;p24h胰腺广泛出血、坏死，胰腺及网膜组织有多处皂化斑。评分统计见表2。表2三组大鼠胰腺he病理评分2.2ay检测结果(见表3)表3三组大鼠ay活性(u/l，xs)注：*表示与n组比拟p0.05;#表示与p6h组比拟p0.05.2.3胰腺hif-1含量检测结果免疫组化染色图显示：n组几乎没有棕黄色颗粒;p6h组和p12h组可见局部细胞胞浆有棕黄色颗粒;p24h组几乎满视野的细胞胞浆内均有棕黄色颗粒，局部细胞核上有棕黄色颗粒。评分统计见表4，免疫组化情况见图28。表4三组大鼠胰腺hif-1免疫组

14、化评分注：*表示与n组比拟p0.05;#表示同一海拔内p组各时点两两比拟p0.05;表示三个海拔间p组同一时点两两比拟p0.05.2.4胰腺x-2含量检测结果(见表5)表5三组大鼠胰腺x-2含量注：*表示与n组比拟p0.05;#表示同一海拔内p组各时点两两比拟p0.05;表示三个海拔间p组同一时点两两比拟p0.05.2.5hif-1、x-2及病理评分的相关关系在hp组：hif-1与病理评分呈正相关关系(r=0.733，p0.05);x-2与病理评分呈正相关关系(r=0.780，p0.05);hif-1与x-2呈正相关关系(r=0.942，p0.05)。在p组、lp组大鼠胰腺组织hif-1、x-

15、2及病理评分三者彼此间都呈正相关关系。3讨论目前公认的sap的始动因素是胰酶的异常激活与释放、胰腺的自身消化8,9，而后引起炎症介质瀑布样级联反响，大量炎症介质进入血流，引发全身炎症反响综合症(systeiinflaatryrespnsesyndr，sirs)，最终导致其他脏器及全身组织受损。由于在始动因素之后，参与的因子众多，机制复杂，至今sap的发病机制尚未完全说明，但细胞因子(ytkine,k)在sap中的重要作用是不容质疑的10。3.1hif-1、x-2与saphif-1是迄今为止发现的惟一一种在缺氧情况下发挥特定作用的转录因子，由120kd的hif-1亚基和9194kd的hif-亚基

16、两个亚单位组成，其中hif-1那么为hif-1所特有11。hif-1蛋白链-末端由约200个氨基酸序列构成，被称为氧依赖性降解区(xygen-dependentdegratindain,dd)。dd区内的两个脯氨酸残基pr402和pr564羟基化调节对于vhl表达的pvhl介导的hif-1降解起关键作用，这就需要氧依赖的脯氨酸羟化酶的参与12。脯氨酸残基羟化后，pvhl才能与hif-1的dd发生互相作用，其功能是作为泛肽配体使得hif-1泛素化，从而被降解。这个过程依赖hif-1降解的增加，而不是其转录的减少11。因此，hif-1在常氧及正常生理情况下在人体内的表达量极少。低氧可以减少hif-

17、1蛋白的降解使hif-1含量增加，而在某些病理情况下，白细胞介素-1(interleukin-1,il-1)、肿瘤坏死因子-(turnersisfatr-,tnf-)等能通过诱导hif-1表达的增加使hif-1含量增加13。环加氧酶(x)又称前列腺素合酶(pgs)，存在“稳定型(x-1)和“诱导型(x-2)两种异构酶。x-2基因与x-1基因明显不同，与x-2相比，x-1基因启动子不含众多增强子元件，因此，可诱导性弱。而x-2基因的启动子那么含有许多与转录有关的序列。因此x-2可被多种刺激因子诱导。x-2在正常生理情况下仅在肾小球及胃肠粘膜有微量表达，只有在受到刺激后x-2才大量表达。现已发现h

18、if-1可以调节vegf、ep、et-1、x-2及转铁蛋白等60多种靶基因14，其功能也不仅仅限于缺氧调节，在炎症中也有重要作用。x-2与炎症性疾病关系亲密，各种炎性疾病和动物模型的炎性渗出液中均发现x-2rna和蛋白表达的增强。x-2是一种即早基因形式，在炎症早期即被激活，多项研究也证实x-2是早期炎症阶段较上游的反响酶之一15,16。hif-1和x-2在炎症中的作用必然也将出如今sap中。我们的研究观察到，hif-1、x-2在正常大鼠胰腺组织几乎没有表达，而在sap组6h有表达，随后逐渐增高，提示在sap的早期，即有hif-1、x-2活化。吴浩等17的研究发现，过久的应用抑酶物质，对于sa

19、p大鼠病情并无明显改善作用，反而抑制了后期抗炎k的释放，而致病情加重，说明sap开展至重症阶段，炎症因子的作用已经超过了胰酶的自身消化作用。我们从实验中观察到，在sap组，从6h到12h，淀粉酶是持续升高的，而12h到24h淀粉酶却没有明显变化;与此同时，12h到24h胰腺病理评分不断进步，说明胰腺损害仍在继续;hif-1、x-2的12h到24h的表达量也是持续升高的，且与胰腺病理评分呈正相关关系。提示到了炎症的后期阶段，胰酶的损害已不是主要原因，hif-1起着很重要的作用。这也解释了为什么胰酶的上下并不能完全反映sap的严重程度。3.2x-2与hif-1在sap中的关系luki18等研究发现

20、，hif-1表达先于x-2，推测前者是x-2表达的调节因子。夏假设寒19等人发如今用氯化钴(l2)诱导的缺氧时，x-2的表达是增加的，而参加ep3-增强子野生片段之后可阻断x-2的表达增加，而ep3-增强子野生片段是hif-1的结合序列，从而证明了hif-1和x-2在缺氧中的联络。他们在随后进一步的研究中发现了x-2基因序列中含有5-tagtgt-3片段，而该片段正是hif-1在基因上的结合位点20。我们在实验中观察到，x-2与hif-1在sap组，从6h即有升高，并随着时间的延长，表达量持续增加，二者都与胰腺病理评分呈正相关，说明二者都参与了胰腺的继续损害，且都发生在胰腺细胞损伤后的环节。二

21、者都与炎症关系亲密，去除其中的任何一个都能在一定程度上阻断炎症的开展。因此我们推断可能存在一条这样的途径：sap时，机体以低氧和非低氧的方式诱导hif-1表达，hif-1活化后作用于x-2等众多靶基因，使其表达程度上调，这些因子加重了胰腺微循环障碍，促进了全身的炎症反响。3.3hif-1、x-2和高原sap的关系和其他的sap一样，高原sap的始动因素也应是胰酶的异常激活与释放，但由于明显的低氧血症和血液粘稠度增高，使sap病情更加严重，常早期就出现sirs。高原地区由于气压低，空气氧含量低，人体动脉血pa2普遍较低。低氧还导致红细胞增多、红细胞压积(ht)升高。ht升高与sap关系亲密21，

22、红细胞的增多导致血液粘滞度增加，血流阻力加大，使胰腺及其他重要脏器更容易发生微循环障碍，而微循环障碍是sap加重的一个重要因素。hif-1可以上调vegf、et-1等目的基因的转录和蛋白合成。vegf、et-1等均能使微循环通透性增加，微循环阻力加大，微血栓形成，最终致微循环障碍，加重胰腺损伤。我们知道，hif-1可调控x-2的表达，而x-2所刺激表达的va-1(血管内皮粘附分子-1)、ia-1(细胞间粘附分子-1)更是加重微循环障碍的重要因素。因此，理论上，hif-1、x-2可能与高原sap病情严重程度有着亲密的关系，但目前对于这方面的研究尚属空白。从实验中我们观察到，三个海拔的n组相比，病

23、理评分及hif-1、x-2均没有明显差异，而在sap组，上述三个指标有显著性差异，提示上述三个指标在发生sap之后才发挥重要作用。高海拔sap组与低海拔sap组、中海拔sap组与低海拔sap组的胰腺病理变化有明显差异，说明高海拔地区sap病情较之低海拔严重。同时，三个海拔的sap组相比，hif-1、x-2都有明显的差异，而且随着海拔梯度的增高，hif-1、x-2的表达量增加。高原出现sap时hif-1表达增高的可能机制为：高本来身的缺氧环境诱导胰腺组织表达更多的hif-1。相关性分析显示，hif-1、x-2都与胰腺病理评分呈正相关，这就提示hif-1、x-2在高原sap加重的环节上发挥了重要作

24、用。而在三个海拔sap组比拟中，ay并无明显差异，提示高原sap病情加重与ay没有直接的关系，ay的上下不能作为高原sap严重程度的重要特征。实验中，我们还观察到高海拔sap组与中海拔sap组相比，胰腺病理变化没有显著性差异。我们考虑可能与海拔梯度不够、高原习服时间太短及样本偏少有关。终究多大的海拔梯度才会有差异，高原习服时间多长才能使机体变化到达高原程度，这些问题尚需在今后的研究中继续探寻。总之，通过本实验可得出以下结论：hif-1、x-2在sap的早期即被激活，被激活的因子可能在sap的起始发病阶段起重要作用，二者在sap后期全身炎症阶段也起重要作用。hif-1与x-2在sap中关系亲密，

25、二者共同参与sap的损害。由于低氧、血液粘稠度增高，高原sap患者胰腺损害、全身病情更加严重。hif-1、x-2在低氧、血液粘稠度增高的情况下微循环障碍加重，全身炎症反响加重，其在高原sap病情进一步开展的过程中产生重要影响。【参考文献】1吴新民,马四清,叶成杰.高原重症急性胰腺炎早期并发多脏器功能障碍综合征的危险因素及治疗策略j.胰腺病学,2022,7(1):6-82李国元,格日力.缺氧性应激反响的分子机制j.青海医学院学报,2022,26(1):67-703puge,ratliffepj.regulatinfangigenesisbyhupxiarlefthesystej.nated,20

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