讨论马钱子碱和士的宁的硅胶柱色谱与半制备高效液相色谱法联用分离纯化

1、111=- 1 =讨论马钱子碱和士的宁的硅胶柱色谱与 半制备高效液相色谱法联用分离纯化111=- 1 =本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档， 请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事 如意！马钱子 Strychnos nux 一 vomica L. 性寒、味苦， 具通络止痛、散结消肿之功效，临床上常用于治疗风 湿痹痛、跌打损伤、麻木瘫痪等疾病。其主要有效成 分为单萜吲噪类生物碱，以马钱子碱、士的宁含量居 多，约占总生物碱70%左右。研究表明，在治疗风 湿痹症的临床应用上，马钱子镇痛作用的有效成分主 要是马钱子碱。传统中医药研究以马

2、钱子中的士的宁 为主要有效成分，而以马钱子碱为毒性成分，炮制方 法力求尽量去除马钱子碱，并且将士的宁的含量作为 马钱子炮制品的质量评价指标。士的宁是一种中枢神 经兴奋剂，医疗中可用于治疗瘫痪、弱视症及再生障 碍性贫尿，但由于其毒性较大，临床应用往往受到限 制。因此分离纯化马钱子碱、士的宁单体，是深入研 究其单一成分的药效及毒性的必要前提。传统分离马钱子碱、士的宁单体的方法多采用硅 胶或大孔吸附树脂，经反复柱层析，再结合重结晶得 到少量纯品，传统分离方法不仅耗时，且浪费溶剂。目前已有文献报道采用高速逆流色谱法分离马钱子碱 和士的宁，但本课题组在应用高速逆流试验中，发现 仪器的稳定性及调试维修等会

3、直接影响分离效果，且 分离条件复杂，两相溶剂体系选择困难，分离时间较 长。半制备高效液相色谱具有分离速度快、产品纯度 高、产率高、重复性好等优点，广泛应用于中药活性 单体的分离纯化，目前未见文献报道采用半制备高效 液相法分离纯化马钱子中有效成分。本文通过硅胶柱 色谱与半制备高效液相色谱法联用快速从马钱子中分 离出马钱子碱、士的宁单体，建立了一种快速分离马 钱子碱、士的宁单体的方法。1仪器与材料1. 1仪器FA1604S分析天平（上海天平仪器厂）; XS205电子微量天平（瑞士 Mettler Toledo公司）； Waters（ 515 - 717 - 486）分析高效液相色谱仪（美国 Wat

4、ers 公司）；岛津（LC - 6AD - SPD -20A - CBM - 20A）半制备高效液相色谱仪（日本岛津公司）;pH酸 度计（OHAVS，STARTER2100）。1. 2试药马钱子碱对照品（批号：110706 - 200505，纯度95. 9%）、士的宁对照品（批号：110705 -200306，纯度97%）均购于中国药品生物制品检定所; 马钱子购于杭州华东中药饮片有限公司，批号:101011，经该公司质检科主管药师郑霄鹰鉴定为马钱 科植物马钱子Strychnos nux - vomica L.的干燥成熟 种子；甲醇、乙腊为色谱纯，其他试剂均为分析纯；柱 层析硅胶200 - 30

5、0日(青岛海洋化工厂)。2方法2. 1色谱条件分析 HPLC色谱条件：色谱柱: Agilent ZORBAXSB - C18 柱(150 mm x 4. 6 mm，5 pm );流动相：乙月青-0. 01mol /L庚烷磺酸钠与0. 02 mol /L磷酸二氢钾等量混合(10%磷酸溶液调pH为 2. 8) ( 21 ： 79);检测波长：254 nm;柱温：25C;流 速：1. 0 ml /min;进样量:20 pl。半制备HPLC色谱条 件：色谱柱：Silica C18M 10E ( 250 mm x10 mm，5 pm);流动相：乙青(A):水-冰乙酸-氨水(230 : 2. 4 : 0.

6、 4) ( B) = 12 : 88;检测波长:254 nm;柱温: 25C;流速：2 0 ml /min;进样量：500 pl。2对照品溶液的制备精密称量马钱子碱、士的 宁对照品适量，甲醇溶解，流动相稀释至浓度分别为 49. 2 pg /mL，49. 0pg /mL。2. 3马钱子总生物碱的提取将马钱子干燥药材粉 碎，过10日筛。称取粉末2. 0kg，按1 ： 10料液比 加入pH 5的50%乙醇溶液浸泡0. 5 h，回流提取3次， 每次1 h，第二、三次残渣加5倍量pH 5的50%乙醇 本文为网络收集精选范文、公文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载溶液加热回流提取，合并提取液，过滤，

7、置旋转蒸发 仪上回收乙醇，浓缩至相对密度为1. 151. 25( 60C)。浓缩液用40% NaOH溶液调pH至12， 二氯甲烷萃取3次，每次加浓缩液体积的2倍，合并 萃取液，减压除去二氯甲烷，即得36. 4g马钱子总生 物碱，其马钱子碱含量为18. 8%，士的宁含量为37. 2%。2. 4马钱子总生物碱的初步纯化称取硅胶约100 g加入至60ml含1%氢氧化钠的95%乙醇溶液中进 行碱化，水浴挥干乙醇后，二氯甲烷湿法装柱(硅胶: 样品量=50： 1)。先用二氯甲烷-甲醇常压梯度洗脱 (100 : 098 : 2)，每个梯度23个柱体积， 除去极性略小的杂质，再用二氯甲烷-甲醇(92 : 8)

8、 洗脱，254 nm处紫外灯光下薄层板检视，收集目标组 分洗脱液，合并，浓缩，旋蒸后真空干燥得1. 375g黄 色结晶，其中马钱子碱含量26. 32%，士的宁含量42. 91%。5半制备HPLC纯化精密称量“2. 4”项下黄色 结晶适量，甲醇溶解，流动相稀释至浓度为10 mg/ml。 按“2.1”项下半制备HPLC色谱条件进行纯化。3结果和讨论1硅胶柱色谱洗脱剂的选择通过薄层色谱，以 马钱子碱、士的宁的Rf值和两组分斑点之间的相对 距离，筛选出柱层析合适的洗脱剂，各种配比展开剂 展开的薄层层析结果见表1。随着甲醇含量的增加， 马钱子碱、士的宁的Rf值逐渐增大。当甲醇含量为 02%时，对照品和供

9、试品相应位置上均未出现马 钱子碱、士的宁斑点，说明此时展开剂的极性低于马 钱子碱、士的宁极性；当甲醇含量大于10%，马钱子 碱、士的宁的Rf差值逐渐减小。综合考虑分离时间， 溶剂用量等因素，最终选择先用二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱(100 ： 098 ： 2)，每个梯度23个柱 体积，除去极性略小的杂质，再用二氯甲烷-甲醇 (92 : 8)洗脱目标组分，薄层板检视。硅胶成本低， 操作简单，绝大多数生物碱都可以采用硅胶色谱法进 行粗分离。但由于硅醇基具有一定的酸性，直接用于 分离生物碱吸附严重。通常通过在洗脱剂中添加碱性 溶液克服，如氨水、三乙胺。实验中通过比较硅胶预 先碱化处理和洗脱液中加碱性溶液

10、两种方法对生物碱 的分离效果，结果发现硅胶经过预先碱化处理后，更 能抑制生物碱的吸附，且分离效果良好。3. 2半制备HPLC色谱条件筛选半制备HPLC 流动相的筛选通过分析HPLC测定相应组分分离度 来确定。考虑到生物碱经半制备HPLC分离后，含盐 流动相后处理步骤繁琐，且易引入其他杂质。本文对 5种流动相进行考察12 14，以士的宁、马钱子 碱的分离度及马钱子碱与相邻其他组分的分离度为考 察指标，各种流动相具体配比及分离度结果见表2。 由表2结果可知，马钱子碱与士的宁在乙腊(A): 水-冰乙酸-氨水(230 : 2. 4 : 0. 4 ) ( B )体系中分 离度稍好。故实验中继续对该体系进

11、行微调，确定最 终选用乙腈(A ):水-冰乙酸-氨水(230 : 2. 4 : 0. 4) ( B) = 12 : 88体系为半制备HPLC流动相。实验 中马钱子碱、士的宁的色谱行为与文献上有较大的差 异，分析可能是因为提取方法的差异导致其色谱行为 的不一致性。分别考察了 1.0，1. 5, 2.0，2. 5, 3. 0 mL/min 流 速对马钱子碱、士的宁分离效果的影响，以分离度， 分离时间及柱压为主要参数进行选择，最终结果表明 在流速2. 0 ml /min时，马钱子碱和士的宁约在45 min 内可完成一次分离，且分离效果良好。实验中同时考 察了进样量为25、50、75 mg马钱子碱和士

12、的宁的分 离情况。当进样量为75 mg时，样品出现过载现象， 分离度急剧下降，综合考虑分离效率及色谱柱保护， 选择进样量为50mg，半制备HPLC色谱图如图1所 示。实验中同时收集了除马钱子碱、士的宁外的其他2个化合物，经分析HPLC（分析基本为单一色谱峰， 面积归一化法测纯度分别为90. 48%、92. 18%。根据 两个化合物ESI - MS结果，M+与M + 2+的丰度 比均约为3 : 1，可以推出结构中均含有一个氯原子， 查阅相关文献，组分111可能士的宁氯甲基氯化物，组 分W可能为马钱子碱氯甲基氯化物，其结构确证和具 体药理活性拟进一步研究。组分111和组分0HPLC色 谱。4结论马钱子中生物碱类成分复杂，各种生物碱结构上 差异往往是连接位置的不同，因此常规单一的分离方 法不仅浪费溶剂，且需要较长