微生物实验医学知识培训课件

1、微生物实验医学知识微生物实验医学知识内 容 提 要 一 肠道杆菌的鉴定（2学时） 革兰染色（1片/人），双糖铁培养 基接种（8支/室），玻片凝集试验（1片/人） 二 药敏试验（0.5学时） 介绍及展示示教平板 三 抗酸染色（2.5学时） 示教，1片/人2微生物实验医学知识内 容 提 要2微生物实验医学知识一 肠道杆菌的鉴定（2学时）3微生物实验医学知识一 肠道杆菌的鉴定（2学时）3微生物实验医学知识病原菌的检验程序增菌培养革兰染色分离培养接种琼脂斜面纯培养采集标本生化试验血清学试验动物试验分析鉴定革兰染色观察菌落特征4微生物实验医学知识病原菌的检验程序增菌培养革兰染色分离培养接种琼脂斜面纯培养

2、采概念：用生化的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反应试验。意义：是鉴别细菌的重要依据。1.细菌的生化反应5微生物实验医学知识概念：用生化的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，生化反应碳水化合物代谢试验各种酶类试验抑菌试验糖发酵试验甲基红试验V-P试验蛋白质和氨基酸代谢试验硫化氢试验吲哚试验碳源和氮源利用试验枸橼酸盐利用试验IMViC试验6微生物实验医学知识生化反应碳水化合物各种酶类试验抑菌试验糖发酵试验甲基红试验V糖发酵试验原理 根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入

3、指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。7微生物实验医学知识糖发酵试验原理7微生物实验医学知识1、确定细菌是否生长2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”表示。3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用“”表示。4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”表示。 结果方法 取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，接种细菌后置37温箱培养1824小时，观察结果。 8微生物实验医学知识1、确定细菌是否生长结

4、果方法 取糖发酵管培养基大肠杆菌伤寒杆菌副伤寒杆菌葡萄糖 +乳糖 - -9微生物实验医学知识大肠杆菌伤寒杆菌副伤寒杆菌葡萄糖 +乳糖 硫化氢产生试验 原理 某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。方法 分别穿刺接种大肠杆菌、伤寒杆菌至两管双糖铁培养基中。37孵育24小时后观察结果。10微生物实验医学知识硫化氢产生试验 原理10微生物实验医学知识结果 沿穿刺线部位呈黑褐色，表明有硫化氢产生，为阳性以“+”表示， 不变色者为阴性，以“-”表示。 大肠杆菌：- 伤寒杆菌：+11微生物实验医学知识结果 沿穿

5、刺线部位呈黑褐色，11微生物实验医学知识2.肠道杆菌的鉴定实验目的： 熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程12微生物实验医学知识2.肠道杆菌的鉴定实验目的：12微生物实验医学知识粪 便增菌培养（必要时） SS 培养基 双糖铁培养基 生化反应血清学鉴定肠道杆菌的鉴定程序已完成革兰染色13微生物实验医学知识粪 便增菌培养（必要时）肠道杆菌的鉴定程序已完成革兰染色1大肠杆菌在SS平板上的菌落特点；伤寒杆菌在SS平板上的菌落特点；（1）观察SS平板上菌落特点 SS平板大肠杆菌 粉红色大菌落痢疾杆菌 无色细小 半透明菌落伤寒杆菌 无色细小 半透明菌落14微生物实验医学知识（1）观察SS平板上菌落特点 （2） 双

6、糖铁培养基接种双糖铁培养基成分含有乳糖和葡萄糖：产酸产气含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成 硫化氢，可形成黑色沉淀酚红指示剂： 酸：黄 碱：红 15微生物实验医学知识（2） 双糖铁培养基接种双糖铁培养基成分15微生物实验医学知各菌的生长特点1)大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），是斜面及底层均呈黄色并有气泡。2) 沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖，不发酵乳糖，分解葡萄糖产的酸使培养基pH下降，酚红指示剂变黄，但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%，在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸，且细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作用，使斜面变红，而底层则为黄色。16微生物实验医学知识各菌的生长特点16微

7、生物实验医学知识双糖铁培养基接种方法 将可疑菌落接种于双糖铁培养基上（穿刺+斜面 ），37度培养24小时，第二天观察结果。17微生物实验医学知识双糖铁培养基接种方法 将可疑菌落接种于双糖铁培养基上双糖铁培养基上各菌的生长现象大肠杆菌黄色有气泡伤寒杆菌上红下黄中间有黑色沉淀福氏痢疾杆菌上红下黄18微生物实验医学知识大肠杆菌黄色有气泡伤寒杆菌上红下黄中间有黑色沉淀福氏痢疾杆菌冲洗染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果（3）革兰染色方法与步骤 1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色 初染（结晶紫） 媒染（卢戈氏碘液） 脱色（95%乙醇） 复染（稀释石碳酸复红） 吸水纸吸干 1m

8、in1min30s30s冲洗冲洗冲洗19微生物实验医学知识冲洗染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果（3（4）伤寒杆菌玻片凝集试验原理： 当颗粒性抗原与其相应的抗体特异结合时，在电解质存在下，两者比例合适时，可出现凝集颗粒，此现象称凝集反应。20微生物实验医学知识（4）伤寒杆菌玻片凝集试验原理：20微生物实验医学知识试剂与器材沙门氏菌属AE群多价O血清，SS平板上菌落，玻片、消毒缸、酒精灯，记号笔等。方法 1.取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。用移液枪分别在两边加沙门氏菌属A-E群多价O血清8微升。 2.无菌操作下用接种环分别取少许SS平板上菌落（黑色或无色菌落，以及粉红色大

9、菌落）与血清混合成均匀乳状(注意：取菌量不宜过多，使悬液呈轻度乳浊即可)。 3.轻轻摇动玻片，经1-2min后观察结果。21微生物实验医学知识试剂与器材21微生物实验医学知识注意事项：注意涂菌时，标明菌落，以免混淆产生错误结果。记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容器内，切勿任意放置或冲洗。 结果观察液体变清，并有乳白色凝集块出现者为阳性。液体仍然混浊，无凝集块出现者为阴性。如待检菌与沙门氏菌属A-E群多价O血清发生凝集，则该菌为沙门氏菌属。22微生物实验医学知识注意事项： 结果观察22微生物实验医学知识（5）结果判断 SS平板：菌落的形态，颜色； 双糖铁培养基上生化特点； 革兰染色：形态，

10、排列，染色特点； 玻片凝集试验结果 23微生物实验医学知识（5）结果判断 23微生物实验医学知识本次实验所做内容杆菌鉴定观察菌落特征（SS平板）取可疑菌落做革兰染色 4片/台 将可疑菌落接种于双糖铁培养基上（穿刺+斜面 ），37度 培养24小时，观察结果. 1支/台伤寒杆菌玻片凝集试验24微生物实验医学知识本次实验所做内容杆菌鉴定24微生物实验医学知识二 药敏试验（0.5学时）25微生物实验医学知识二 药敏试验（0.5学时）25微生物实验医学知识目的要求1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定2.了解药敏试验的操作方法和意义26微生物实验医学知识目的要求1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果

11、判定26微生物原理含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。27微生物实验医学知识原理含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片主要材料1.大肠杆菌菌液普通琼脂平板2.含抗生素的滤纸片： 青霉素 氯霉素 链霉素 庆大霉素28微生物实验医学知识主要材料28微生物实验医学知识方法标记分区密涂接种贴片培养结果观察29微生物实验医学知识方法标记分区29微生物实验医学知识1.标记分区底部观3

12、0微生物实验医学知识1.标记分区底部观30微生物实验医学知识2.密涂接种 分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转60度二次密涂接种，然后同方向旋转60度后再次密涂接种。顶部观31微生物实验医学知识2.密涂接种 分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转微生物实验医学知识培训课件4.培养置37温箱， 倒置培养18h-24h33微生物实验医学知识4.培养置37温箱，33微生物实验医学知识青霉素链霉素庆大霉素氯霉素 五、 结果 抑菌圈抑菌圈直径34微生物实验医学知识青霉素链霉素庆大霉素氯霉素 五、 结果 结果观察抑菌圈直径15mm 高度敏感抑菌圈直径10-15mm 中度敏感抑菌圈直径10mm

13、 低度敏感无抑菌圈 不敏感或耐药35微生物实验医学知识结果观察抑菌圈直径15mm 高度敏感35微生物实验注意事项接种时均匀密涂贴片时，用无菌镊子轻轻触压药物纸片使之与培养基充分接触贴片后不能再更改纸片位置镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响整个贴片过程应在15min内完成36微生物实验医学知识注意事项接种时均匀密涂36微生物实验医学知识一、实验目的：1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握抗酸染色的原理和方法三 抗酸染色37微生物实验医学知识一、实验目的：三 抗酸染色37微生物实验医学知识分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围

14、在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。二、实验原理：38微生物实验医学知识分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽三、实验材料：细菌：卡介苗 （Bacillus Calmette-Guerin， BCG）染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美兰溶液其它：接种环、酒精灯、载玻片等39微生物实验

15、医学知识三、实验材料：39微生物实验医学知识四、实验方法：1、细菌涂片标本的制备 涂片 干燥 固定2、染 色1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。2）脱色： 3%盐酸酒精脱色301；用水冲洗。3）复染：用碱性美兰溶液复染1；用水冲洗后用吸水纸吸干。40微生物实验医学知识四、实验方法：1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红3、油镜观察未染色 初染后 脱色后 复染后初染脱色复染镜检41微生物实验医学知识3、油镜观察未染色 初染后 脱色后五、实验结果：结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。42微生物实验医学知识五、实验结果：结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝43微生物实验医学知识43微生