超高效液相色谱

1、第39卷2011年11月分析化学（FENXl HuAXUE研究报告Chinese Joumal of Anal”ical Chemistry第 ll 期 17321737 DoI:10.3724/SP.J.1096.20“.01732 超高效液相色谱一串联质 谱快速筛查葡萄酒中的14种禁用食品添加剂冯峰1杨烁2凌云1江桂斌3储晓刚叫（中国检验检疫科学研究院，食品安全研究所，北京100123 :（哈尔滨医科大学，哈 尔滨1500813（中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学重点实验室。北京 100085摘要建立了同时测定葡萄酒中14种禁用食品添加剂的超高效液相色谱一电喷 雾电离串联质谱

2、（uPLc ESIMs/Ms分析方法。采用uPLC BEH C18（100mmx2.1mmx1.7“m色谱柱，对流动相的组成、缓冲液离子强度及质谱的各种参数进行了优化。结果表明,流动相的离子强度对食品添 加剂的质谱检测有重要影响。以含1mmo1/L甲酸铵一甲酸缓冲液（pH 3.9 一乙腊为流动相，梯度洗脱，柱温 35C,可以在6min内完成14种食品添加剂的分离和检测。在ESI负离子模式下，采用选择离子监测方法进行测 定时，除三氯蔗糖、日落黄和酸性红13的检出限分别为10,2和2pg几外，其它11种的检出限在O.O11.O pg/L 之间。回收率为93.8%106%,相对标准偏差小于3.1%。

3、本方法快速、准确、灵敏度高,可用于葡萄酒 及其它复杂基质食品中的低剂量、多种禁用食品添加剂的同时筛查。关键词超高效液相色谱;串联质谱;食品添加剂;葡萄酒1引言葡萄酒是新鲜葡萄或葡萄汁经发酵而成，富含有机酸、糖类、黄酮类、酚类和 原花青素等功能成分，适量饮用能够预防多种疾病“二】。国家标准GB2760-2007 食品添加剂使用卫生标准在葡萄酒中仅允许添加焦糖色作为着色剂，三氯蔗糖 作为甜味剂，除此之外禁止添加任何种类的着色剂和甜味剂【3】。近年来,在葡萄 酒中添加非法着色剂和甜味剂的情况时有发生，为了保障葡萄酒的饮用安全,有必要 建立一种快速、准确、灵敏的方法对葡萄酒中的禁用食品添加剂进行测定。

4、目前，检测食品中着色剂和甜味剂的方法有高效液相色谱】、紫外分光光度 法嘲、离子色谱法m、毛细管电泳法【8一101及液相色谱一质谱法.151等。 由于使用液相色谱一紫外分光光度法不能提供结构信息，而葡萄酒成分又较复杂，因 而在检测微量成分时容易发生假阳性或假阴性现象。近年来,质谱技术已在食品中 添加剂的筛查方面显现出显著优势“”4】。然而目前所报道的质谱方法多采用传统 的色谱条件，其中所用的醋酸铵或是甲酸铵溶液缓冲液浓度多大于20mmol刖12一 14】。研究表明，过高的离子浓度对分析物的电离具有较强的抑制作用“”7l。因此， 为提高检测的灵敏度，增强对食品中禁用物质的筛查能力，有必要对质谱分析

5、时缓冲 液的浓度进行优化。本研究建立了同时高灵敏、快速筛查葡萄酒中14种禁用甜味 剂和着色剂的超高效液相色谱（uPLC 一串联三重四极杆质谱（QQQ方法，对色谱分离 中缓冲液的浓度对质谱检测的灵敏度的影响进行了探讨。本方法已成功用于葡萄 酒中禁甩添加剂的快速检测。2实验部分超高效液相色谱仪（UPLC,美国waters公司;串联API 5500三重四极杆质谱仪 （美国Applied Biosystems公司，配备waters uPLC自动进样器,柱温箱，数据采集由 Analyst 1.5.1 软件完成。糖精钠（sodi啪sacch撕n、安赛蜜（Acesul伽ne、阿斯巴甜（Aspan锄,购自美

6、国 supelco 公司;甜蜜素（sodium cyclamate、纽甜（Neot 锄 e、丽春红 2R（Ponceau 2R、丽春红 3R（Ponceau 3R、丽春红 sx（Pon 一 20110218 收稿;20l 卜 0505 接 受本文系北京市科委科技计划项目（No.D08050200310803和科技部科技支撑计划 项目（No.20llBAKlOB04 资助+E 一眦 il: HYPERLINK mailto: 第ll期冯峰等:超高效液相色谱一串联质谱快速筛查葡萄酒中的14种禁用食品 添加剂1733ceau $乂。购自德国 Dr.Ehrenstorfer 公司;三氯蔗糖（sucra

7、lose、日落黄（sunset Yellow FCF、诱惑红（Allura Red、红色 2G（Acid Red 1、酸性红 13（Acid Red 13、赤 薛红（Erythrosine、甲酸、甲酸铵,购自美国sigma公司;实验室用水由Millipore纯水 仪制备。10份葡萄酒样品购自超市。2.2标准溶液的配制准确称取适量上述标准品，用水溶解并定容,配制成looO mg/L的单标储备液;准 确移取各标准储备液O.5mL，混合于100mL容量瓶中，用水定容,配制成5mg/L的混 合标准工作液。用水逐级稀释，制成浓度范嗣为0.1500“g/L的系列混合标准溶 液。取葡萄酒样品10mL于50m

8、L烧杯中，超声脱气10min;取脱气后的样品1.O mL 于10mL具塞试管中，用水定容至10mL,过0.22“m滤膜后分析。2.4色谱一质谱条件uPLc BEH C18 色谱柱（100mmx2.1mmx1.7pm,美国 waters 公司。流动相 A 为乙 腊,流动相B为l mmol/L甲酸铵一甲酸缓冲液（pH 3.9。流速O.3mL/min,进样体积2 肛L,柱温35C;梯度洗脱程序:01.5min,7%A;1.57.O m氓7%90%A;7.010.O min,90%A。电喷雾电离源，负离子模式，多反应监测（MRM;实验所用气体均为高纯液氮，碰撞 气（cAD压力为41.4kPa,气帘气（

9、cuR压力为138kPa,雾化气（Gsl压力为448kPa，辅助 气（Gs2压力为414kPa。电喷雾电压（IS为一 4.5kV去溶剂温度（TEM为500C,Q0 入口电压（EP lO V碰撞室出口电压（CxP为一 ll V,14种添加剂的定性/定量离子 对、碰撞电压（cE及去簇电压（DP见表l。表114种食品添加剂检测的最优质谱参数T 曲 le lOptimum p 盯 ameters alld selected 矗 agment ions for 14food additives定量离子（Quami断ng ion。734第39卷3结果与讨论3.1流动相条件优化文献【12”&道，采用高效液相

10、色谱一串联质谱检测葡萄酒中5种甜味剂时.这些 甜味剂在甲醇一 20mmol/L甲酸铵一甲酸体系的保留时间与甲醇一 20mm01几醋酸 铵一醋酸体系一致，同时部分甜味剂的灵敏度提高了 15倍以上，这说明甲酸铵体系 可以获得比醋酸铵体系更高的灵敏度。stom等”“的研究表明.溶液巾的Ni4浓度严 重影响质谱检测的灵敏度。Minj06等”1的研究表明，使用乙腊分离着色剂可以获得 比耳I醇更好的峰对称性。因此，本研究以乙腊20mm01/L甲酸铵（含0.1%甲酸,pH 39 为流动相,对所研究的14种食品添加剂的分离条件进行了优化,14种添加剂可以在 6min内得到较好分离（见图1。考察了缓冲液的浓度对

11、添加剂的信号强度的影响。 选用的甲酸铵一甲酸（pH 39缓冲液的离子浓度分别为20,10,5,25和1mmol,L。研究 表明，随着缓冲液浓度的降低,溶液中的离子强度相应降低（图2,但各添加剂的保留 时间基本不变，这说明离子强度的降低并未对待分析物的分离度产生影响。然而，待 分析物的峰高却显著提高（见图3。由于部分着色剂未实现基线分离。为避免相互 问的竞争抑制效应对分析结果的影响，在此仅以6种甜味剂的峰高的变化对其进行 表征。从图3可见,6种甜味剂的信号强度随流动相离子强度的降低而不断提高，这 说明过高的离子强度确实对添加剂的质谱检测有离子抑制作用。为取得最高的灵 敏度，本研究选择乙腊一 1m

12、m01几甲酸铵甲酸体系作为14种添加剂的0123456IV mln罔l优化条件下14种添加剂的多反应监测色谱图Flg.1MRM chromatogram of 14food addltiVes unde optimum separation conditions各编号对应分析物虬表】（Numbersof allalytes are s枷e as m Tablel。图2不同 浓度甲酸铵缓冲液的电导率Fig 2Electnc conductivity of ammonjum f0 邢 atebu 髓 r under difkrent concentration安赛蜜糖精钠甜蜜索三氯蔗糖#町斯巴甜纽

13、甜AcesuIhme Sodlum Sodlum Sucralose AsDarbme NeO 诅 me Sacchann Cyclamate罔36种甜味剂在流动相中不同离子强度下峰高比较F1 昌 3comp 州 son of thee 讯 ct of amine concentration in mobile Phase on the Peakheights of 6sweeteners第ll期冯峰等:超高效液相色谱一串联质谱快速筛查葡萄酒中的14种禁用食品 添加剂1735分离体系。需要说明的是，考虑到葡萄酒中的禁用添加剂一般浓度较低,加标分 析也表明低于l mg/L浓度水平的添加剂不会产生

14、过载现象，所以本研究选择了此浓 度水平的缓冲液。在对确定含有较高浓度水平的甜味剂或是着色剂进行检测时，则 需要选择较高浓度水平的缓冲液。3.2方法线性、回收率、精密度及检出限在上述实验条件下，考察14种添加剂在O.1500pg/L浓度范围内的线性关系和 相关系数，并以14种添加剂的信噪比为3时的进样浓度为检出限。回收率和精密度 的测定通过向阴性葡萄酒样品中添加lO“g/L甜味剂混合标准溶液进行，每个浓度样 品平行分析3次。结果见表2。表214种添加剂的线性范围、线性方程、相关系数、添加回收率、精密度及检 出限(咒一 3玑 lble 2Linear r 粕 gecorrelation coemc

15、ients，limits of detection(LOD，recoveries 粕 d rclative st 明 dard deviatiss(RSDof 14 food additives.llle recoveries were eval 岫 ted by con 们 lling the fortification leVel of each dye insgatiVewine 蛐 ples at 10p 班(疗 23序号代表分析物名称同表l(Numbers of锄lytes are s锄e鹤in T曲le 1;+添加浓 度为 100pg 几(Spiked cones廿 ation w

16、 鹊 loo“g,L。3.3方法应用对北京市市售1O种低价格的红葡萄酒样品进行测定，根据各添加剂的保留时间 及选择的两对子离子峰高的比值进行定性分析。结果表明，有5个样品含有禁用添 加物,且均为甜味剂（表3。除了允许添加的三氯蔗糖外，还含有糖精钠、甜蜜素和 纽甜3种甜味剂（图4。其中对于糖精钠,由于其定量离子和定性离子的强度相差约 60倍,而其在样品中的浓度又较低，因此，通过对其进行加标回收，根据保留时间和回 收率进行了确证。表3实际葡萄酒样品的检测结果T 曲 le 3Quantification results of f 酞d additiVes in positive wine sampl

17、es by UPLCMS/MS1736分析化学第39卷181I1.21.6I 2.02.4I:Max 1383,82.1-+62.O 1.82.O 2.2:1.62.O 2.41.82.O ,min，/min图4葡萄酒阳性样品色谱图Fig.4Chromatograms of p08itiVe s 锄 ples in wines4-64.85.O 5-25.4才广一乏矿一矿一1 苣 14，/millReferenc 姻1ZHA0Ren-Jun（赵任军.Si咒D.Dw%s Gr4户P讲咒P删d V“聍P（中外葡萄与 葡萄酒,2006,2（5:51532xIE Ya-Li,CHEN Xin-Xin,

18、FENG Yong,YANG Bin （谢娅黎,陈欣欣，冯勇，杨 彬.Mo 如 r”Fbod Sci 绷 cP 口咒 d n 如竹 oZogy（现代食品科技,2009,35（12;148214833GB2760 一 2007.Hyg抬卵记S缸挖如谢s扣r弧Ps o厂F00d Add以i伽s（食 品添加剂使用卫生标准.National Standards of the Peopl e,sRepub1ic ofChina（中华人民 共和国国家标准.Beijing （北京:Standards Press ofChina（中国标准出版社,20074Minioti K S,sake11ariou C F

19、,Thomaidis N S.A 行 dZ.C,1i 研.Ac 抛,2007,583（1:1031105YANG Liu_Hua,WANG Lin,SUN Cheng-Jun（杨柳桦，王林，孙成均.呖 i 打 PsP.,o“rndZ D,A 程口 Z 沙如 L 口 60mtD 删（分析试验室,2007,26（7:79826ZHU0Jing,wANG Jing,CHEN Xiao-Xia,TANG Xin_Hua,QIU Bin,ZHU E 卜 Yi,CHEN Xi（卓靖，王静，陈小霞,邱彬,朱尔一，陈曦.C矗i卵Pse.,.A张口 Z.C1I1 优.（分析化学,2011,39（2:283287

20、7Chen Q C,Mou S F,Liu K N,Yang Z Y,Ni Z M.,C111 加 mn 加 gr.A,1997,771（1:1351438Zhu Y,Guo Y Y,Ye M L,James F S.,.CAm 优 nfogr.A,2005,1085（1:1431469Dossi N,Toniolo R,Pizza“ello A,Susmel S,Perennes F,Bontempelli G. _,. EZP 订 r0 盘竹 nZ.（冼 P 优.,2007, 601（卜 2:1210Ryvo1ov 丘 M,T 丘 borsky P,Vrdbe1 P,Krdsensky P

21、,Preis1er J.J.C1I1,- omnfDgr.A,2007,1141（2:206211 11sHENG Xuan,CHEN ChangJun,DING zhen.Hua,SuN Janwen,DING YamSheng,ZHENG Ping（盛旋，陈昌 骏,丁振华，孙建文, 丁袁生，郑屏.Cai行P5P-,D“r” 口 z D,A行口 zys缸Ld60mfD删（分析试验 室,2006,25（7: 757812JI Chao,FENG Feng,CHEN Zheng-xing,SUN Li,CHU Xia0-Gang（嵇超，冯峰，陈 正行，孙利，储晓刚.C_ Ili行PsP _rD“

22、册口 Z D,ClIlmm ogm户 曾（色 谱,2010,28（8:74975313QIN Fang,WANG Lin-xiang,TA0Guan_Jun（秦叻。王林祥,陶冠军.Liq“D 产 M 口最 i 珂 g SfiP 行 fP&nf人行 DzDgy（酿酒科技.2005,21（9:848614Ma M,Luo X,Chen B,Su S,Yao S.,.CAro 优口 fo 譬 r.A,2006,1103（1:17017615Sun H W,Wang F C,Ai L F.-,.CArDm 口 ogr.A,2007,1164（卜 2:12012816Storm T,Reemtsma T

23、,Jekel M.,.CAromn ogr.A,1999,854（12:17518517Holapek M,Jandera P,Zderadika P.,.CArDmn Dgr.A,200l,926（1:175186第11期冯峰等：超高效液相色谱一串联质谱快速筛查葡萄酒中的14种禁 用食品添加剂 1737 Simultaneous Screening of 1 4 IHegal FoodAdditiVes inWines UsingUl tra Performance Liquid Chromatography T andemMass SpectrometryFENGFen91,YANG Sh

24、uO2I,INGYun1,JIANGGui Bin3,CHU Xi ao.Gang1 1（j 打盯if 抬D ,FoDd Sq归 fyCi 疗Ps PAc 口dPmj,D,J”spP“i o行口行d Q。阳，.口九fi理P,B P巧i拧 g 1 0 0 1 2 3 ） 2 （HII 而i船胁 dif “Z L肺 iw”i 砂，H口 r6i 疗150081） 3 （Stn 托Key eaborQtory of En峨 ronm 阴 tnf ckmisry nnd Ecrto 面co 1ogy,Re senrch cetlter 如r Ef扩E行讲r 口行mP玎细z SfiF 行f Fs,Ci 竹

25、P5已Af口dP 优yD,SfiP柙fFs,BP 巧ing 1 0 0 0 8 5 ） Abstract An ultra performance li quid chromatography electrospray ioni zation tandemmass spectro screening 1 4 illegal food additivesCacesul 一metric (UPLCESIMS/MS)method for the simulta neous fame,sodiumsaccharin,sodiumcyc lamate,aspartame,neotame,sucralos

26、e,p onceau2R,ponceau3R,ponceauSX,sunset yellowFCF,aUura red,acidRed l,acid re d l 3,erythrosine)inwines has been deve loped.TheHPI,Cseparationwas carried out using anUPLCBEHCl8(l 00 mmx 2.1 mmx 1.7 “m)as solid phase. Several parameter s,including the compositions and ion st rength of the mob 订ephase

27、,and themonito r ions were optimized for improving the c hromatographic performance and the sens itivity. The results demonstrated that the sensitivity could be significantly influenced by the amine concentration i n the eluent. 1 The separation could be co mpleted jn less than 6minwhen using asm mo

28、l/L ammonium formateformic acid buff er(pH3.9)and acetonitrile at the mobil ephases,gra dient elution.The column temperature was kept 35C.When the analy tes were detected byESI一 MS under selec ted sunset ionmonitoringmode,thedete ction limits were 0.01 1.0 pg/L except s ucralose, The average recover

29、ies yellow FCF,acid red 1 3whichwere 10,2 and 2 pg/Irrespectively, ranged from93.8%to 10 6%.The relative standard deviations wer e less than 3.1%.This method is rapid,ac curate,highly sensitive and suitable fo r the quality control of lowconcentrati on andmixtures of food additives whichw ere illega

30、Uy added Keywords to wines and other foods. Ultra performance liquid c hromatography；Tandemmass spectrometr y；Food additives； Wines (Received 18 Fe bruary 2011；accepted 5 May 2011) 一蕾._量 + 圣+量+圣.重.壬圣一圣q.量一q一一一一扣量量扣圣+ 一量+_圣+_圣+_壬+_圣._量一童._量,量一量一圣一圣 圣._圣._圣._圣._圣,一圣量一圣一 q圣一量一圣q -量色 谱在材料分析中的应用该书为色谱技术丛书

31、之一，系统介绍了材料分析中 应用的各种色谱方法与技术。内容包括气相色谱、高效液相色谱、离子色谱、凝 胶渗透色谱、毛细管电泳以及一些联用技术在无机材料中的金属元素和非金属元素 的分析、无机材料和高分子材料结构分析、聚合物中可挥发物质的分析、高分子 材料定性定量分析以及高分子材料分子量分布分析中的应用，并综述一r色谱法 在材料分析中的应用进展。书中列举了大量的应用实例。便于读者在实际T作中参 考。该书可供材料、冶金、高分子科学与工程、环境保护等领域中从事材料分析 的技术人员参考。该书(ISBN 9 7 8 7 1 2 2 一 1 0 5 6 7 7 )由化 学工业出版社，胡净宇、梅一飞、刘杰民等编

32、著，定价4 2.o。万方数据超高效液相色谱-串联质谱快速筛查葡萄酒中的14种禁用食品添加剂作者： 作者单位：冯峰，杨烁，凌云，江桂斌，储晓刚，FENG Feng，YANG Shuo， LING Yun，JIANG Gui-Bin，CHU Xiao-Gang 冯峰，凌云，储晓刚,FENG Feng,LING Yun,CHU Xiao-Gang(中国检验检疫科学研究院，食品安全研究所，北京100123，杨 烁,YANG Shuo (哈尔滨医科大学,哈尔滨,150081，江桂斌,JIANG Gui-Bin (中国科学 院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学重点实验室，北京100085分析化学 Ch

33、inese Journal of Analytical Chemistry 2011,39(11 1 次 刊名：英文刊名：年，卷 (期：被引用次数：参考文献(17条1.赵任军查看详情2006(05 2.谢娅黎陈欣欣.冯 勇.杨彬查看详情2009(12 3.GB2760-2007食品添加剂使用卫生标准2007 4.Minioti K S.Sakellariou C F.Thomaidis N S Determination of 13 synthetic food colorants in water-soluble foods by reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detecto